ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

稻瘟病菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1的功能研究分析

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一种在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中,蛋白激酶CK2高度保守,包含2个调节亚基和2个催化亚基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分别编码MoCK2的2个调节亚基,MoCKa编码稻瘟病菌MoCK2的催化亚基。运用反向遗传学策略和同源重组原理,对MoCKa-GFP的pull-down实验结果中获得的一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1进行功能分析。经过生物信息学研究分析发现Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能,同时与其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有较高同源性。在获得基因敲除突变体后,通过表型分析发现,与野生型Ku80相比,ΔMoppz1突变体菌落的营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但分生孢子的萌发和附着胞的形成滞后于野生型菌株,且对水稻的致病能力减弱。激光共聚焦显微分析表明,MoPpz1定位在菌丝、分生孢子和附着胞的细胞质中。综上所述,蛋白磷酸酶MoPpz1可能参与稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对水稻致病性的调控。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。     

绿僵菌Marho2基因功能初步分析

绿僵菌广泛应用于农林害虫的防治,成功侵染寄主昆虫的过程中均伴随着细胞形态的变化,是细胞极性建立和骨架重排的结果。Rho家族中Rho2基因在参与调控细胞极性生长和正常的形态建成中发挥着重要作用。为了探究Marho2基因在绿僵菌生长发育与侵染致病过程中的功能,采用同源重组的技术构建Marho2基因的敲除载体,利用农杆菌介导转化法获得Marho2基因的敲除菌株(ΔMarho2),并对其进行分析。结果表明:与野生型菌株相比,Marho2基因调控绿僵菌的生长发育和致病力,Marho2基因的缺失降低了绿僵菌的毒力、产孢量及孢子萌发延迟,抑制了绿僵菌的湿热耐热性和抗紫外能力。      

稻瘟病菌基因表达特征及其生物信息学分析

Rho GAPs（GTPase activating proteins）是真核生物中Rho GTP酶的负调控因子之一,通过激活Rho GTP结合蛋白内在的GTP酶活性,使其加速水解成结合GDP的失活态。全基因组分析指出稻瘟病菌有8个Rho GAP成员（MoRhoGAP）,但是其功能不清。本研究利用在线工具分析了其蛋白MoRhoGAP蛋白结构域及其定点突变后的三级结构,以及MoRhoGAP的互作蛋白网络,构建了系统发育树;利用基因芯片和公共数据库分析了在稻瘟病菌不同发育和侵染阶段Rho GAP的基因表达情况,为进一步研究稻瘟病菌RhoGAP的功能提供了理论依据。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。     

稻瘟病菌MGG14093基因功能的初步研究

根据之前的基因芯片分析,发现在稻瘟病菌侵染水稻的过程中,许多基因被诱导表达。MGG14093为其中一个推测为编码分泌蛋白的未知功能基因,在病菌侵染过程中该基因表达量上调2.906。利用生物信息学在线软件对该基因编码蛋白的特性进行初步分析,并通过RT-PCR扩增进一步分析该基因在稻瘟病菌侵染水稻过程中的表达动态,利用基因敲除和过量表达技术对该基因的功能进行初步研究。结果表明:该基因编码蛋白为定位于胞外的分泌蛋白,没有已知的蛋白结构域,但可能存在几处氨基酸活性位点。MGG14093基因敲除和过量表达后,对稻瘟病菌的营养生长、产孢及附着胞分化没有显著的影响,但该基因过量表达后导致病菌的致病力下降,表明该基因可能参与病菌的致病过程。本研究结果为进一步揭示MGG14093基因的生物学功能奠定了基础。     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

 通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体。突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应。携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当。免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外。这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性。     

水稻白叶枯病菌hrcU基因缺失突变体构建及功能研究

通过基因敲除方式,构建了水稻白叶枯病菌hrcU基因的缺失突变体.突变体丧失了在水稻上的致病性和在非寄主植物上的过敏反应.携带hrcU基因的黏粒完全互补了hrcU突变菌株的表型,互补菌在水稻组织中的生长能力也与野生型菌株相当.免疫杂交结果显示,hrcU基因突变后,水稻白叶枯病菌的Harpin蛋白Hpa1不能从细胞内分泌到胞外.这些结果表明,水稻白叶枯病菌hrcU基因的主要功能是形成Ⅲ型分泌系统,将效应分子分泌到病原细菌胞外,从而决定了在非寄主上的过敏反应和在水稻上的致病性.     

稻瘟病菌分生孢子发芽和附着胞形成的影响因素研究

在8种培养基膜,多种cAMP、IBMX浓度梯度的琼脂表面膜,不同营养液及pH值条件下,研究了稻瘟病分子孢子发芽和附着胞形成的状况,并对稻瘟病拮抗细菌培养液的作用进行了研究。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 91-11B1的分生孢子悬浮液浓度在10000~1000个/mL 和pH值在7.0为最适孢子萌发条件,但不影响附着胞的形成。疏水基物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。2.5 mmol/L cAMP和8.0 mmol/L磷酸二酯酶抑制剂IBMX显著地促进附着胞的形成。与去离子水和水洗法相比,自来水和振落法获得的分生孢子更有利于附着胞的形成。筛选到3株对孢子发芽及附着胞形成有强烈抑制作用的拮抗细菌     

橡胶树胶孢炭疽病菌致病相关基因CgATG8的功能分析

ATG8是病原真菌中细胞自噬过程中的重要基因,并参与致病过程。基于橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组数据库,采用PCR和RT-PCR扩增得到橡胶树胶孢炭疽病菌的CgATG8基因并进行序列分析。采用Split-Marker Recombination法获得该基因的敲除转化子。表型分析结果表明,缺失该基因后,橡胶树胶孢炭疽病菌的致病力丧失,产孢能力、孢子萌发率、附着胞形成率和膨压均降低,而且孢子萌发和附着胞的形成延迟。     

香蕉黑星病菌侵入前发育的Ca2+/CaM依赖信号研究

测定Phyllosticta musarum 在不同疏水性的人工表面上的孢子萌发率和附着胞形成率,以及Ca2+,CaM依赖信号系统是否参与了P.musarum侵入前阶段的发育调控.结果表明,P.musarum在侵染寄主时形成一种专门的附着胞作为侵染结构,刚性的疏水表面有利于诱导P musarum分生孢子的萌发.刚性表面则有利于附着胞的形成,而对这种与侵染相关的特化结构即附着胞的发育影响不显著.加入外源Ca2+,不论浓度如何都能促进分生孢子萌发,而附着胞形成率在高浓度外源Ca2+存在时则明显下降.Ca2+敖合剂EGTA有抑制孢子萌发和附着胞形成的作用,但在EGTA中加入Ca2+载体A23187和CaCl2可部分缓解EGTA的这种抑制作用.磷酸酯酶C(PLC)抑制剂Neomycin可以抑制附着胞形成.Ca2+通道阻断剂TMB-8和Nicaldipine,CaM拈抗剂Chloropromazine在微摩尔剂量水平上均可抑制附着胞形成.证明由Caz+/CaM信号系统控制的生化过程参与了P.musarum在寄主香蕉表面侵入前的形态建成.     

稻瘟病菌对新型模式植物二穗短柄草的致病性研究

 建立了稻瘟病菌对二穗短柄草的接种体系,观察了稻瘟病菌在二穗短柄草上的发病过程和特点,并与在水稻和大麦上的发病情况进行了比较。在人为接种稻瘟病菌的条件下,二穗短柄草的叶片、叶鞘、茎秆、穗部均可获病。利用稻瘟病菌孢子悬浮液对二穗短柄草进行苗期活体或离体接种,都能引发典型病斑。与大麦相比,二穗短柄草叶片上病斑的出现时间及发展速度更接近水稻。同时,二穗短柄草叶片上的接种和发病条件比水稻更易控制,病斑更具一致性。另外,稻瘟病菌致病突变体在二穗短柄草叶片上致病性变化（降低或丧失）趋势与在水稻上的情况一致。显微观察及组织化学染色表明,稻瘟病菌在二穗短柄草叶片上可有效形成附着胞,侵入叶片表皮细胞,形成典型的侵染菌丝,其过程与水稻近似。因此,二穗短柄草可以作为稻瘟病菌与寄主互作的研究材料,并有望为杂草上梨孢菌的研究提供可能的模式植物以及为农作物的抗病育种提供参考。     

空间诱变育成抗稻瘟病和白叶枯病水稻突变体浙101

 早籼浙9248经卫星搭载诱变处理，种子的发芽率及当代植株的性状均没有明显的变化，但对秧苗的生长表现出一定的刺激作用；SP2在株高、生育期、穗长、每穗粒数、千粒重、结实率及抗病性等性状上出现了较大的分离。经病区多代筛选培育成的突变体浙101，在熟期、抗病性和产量等性状上比原亲本有明显改良，2001~2002年经浙江省多点稻瘟病和白叶枯病联合鉴定，叶瘟平均级分别为1.4和1.7级，最高级为5.0级；穗瘟平均级分别为1.6和1.3级，最高级为3.0级；抗谱频率分别为70%和60%；对白叶枯病抗性平均级为1.4级，最高级为5.0级。抗病性比原亲本和对照有显著提高。试验表明，浙101是一个高抗稻瘟病兼抗白叶枯病的水稻突变体，可作为水稻品种改良的新抗源。     

水稻蛋白磷酸酶ABI2基因启动子的克隆和功能分析

分离了水稻PP2C家族中的一个成员OsABI2的启动子,测序鉴定后构建其GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的方法获得水稻转基因植株。GUS蛋白组织化学染色结果表明,OsABI2启动子驱动的GUS基因在水稻根茎叶中都有表达,在根中表达量最高,叶中表达量最低,而且根部分生组织区明显高于根部其他组织。另外在萌发的芽中也有明显表达。OsABI2启动子在T1代转基因植株的诱导表达的GUS蛋白活性分析结果表明,在机械损伤、稻瘟病、干旱逆境和ABA、MeJA和SA处理条件下,OsABI2启动子驱动的GUS活性都出现了明显上调。上述研究结果说明,OsABI2很可能参与了发育,生物和非生物逆境胁迫的调控。