应用间接ELISA方法检测猪附红细胞体抗体

近年来,国内外对附红细胞体病的研究已取得一定进展,针对此病的血清学诊断先后建立了CFT、IHA、ELISA、IFAT等检测方法,这些血清学诊断方法所用抗原均为附红细胞体的粗提抗原。而本试验对猪附红细胞体抗原进行了提纯,并进行了免疫性分析,用具有最好免疫性的提纯抗原建立了检测猪附红细胞体抗体间接ELISA方法,并与IHA进行了比较,旨在为猪附红细胞体病的流行病学调查及疫病监测提供简便、快速、特异、敏感的检测方法。1材料与方法1.1主要材料96孔酶标板为MaxiSorp公司产品;羊抗猪IgG-HRP为美国KPL公司产品;猪肺炎支原体、猪瘟、…     

蛋白酶抑制剂对猪附红细胞体抗原保护作用的研究

附红细胞体病（eperythrozoonosis）是附红细胞体（Eperythrozoon）寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中,引起的以红细胞压积降低、血红蛋白浓度下降、白细胞增多、贫血、黄疸、发热为主要临床特征的人兽共患病。近年来,国内外对附红细胞体病的研究已取得了一定进展,但在抗原方面的研究尚少见。在国内,贾立军等对猪、羊附红细胞体抗原进行了分析,但尚未对抗原的降解作用进行研究。试验用分光光度法和SDS—PAGE电泳技术应用蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor）对猪附红细胞体抗原的保护作用进行了研究,以期为猪附红细胞体抗原的长期保存提供科学的理论依据。     

猪附红细胞体巢式PCR诊断方法的建立及初步应用

为建立一种更加准确、敏感的猪附红细胞体检测方法,本试验根据猪附红细胞体特异的DNA序列(AJ504999)设计2对巢式PCR引物,建立了巢式PCR检测方法。筛选该检测方法的最佳反应条件,并进行了特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的巢式PCR对猪附红细胞体基因组DNA能扩增出特异性片段,而对弓形虫、链球菌、牛瑟氏泰勒虫、牛附红细胞体基因组DNA扩增反应结果均为阴性;DNA最低检测量为0.124 fg/μL;通过对55份临床样本的检测,该巢式PCR较常规PCR的阳性检出率高23.7%。本试验为猪附红细胞体病的诊断提供了一种更为特异、敏感的检测技术。     

猪附红细胞体病诊断方法研究进展

附红细胞体病(eperythrozoonsis)是由附红细胞体(eperythrozoon)感染动物机体后,寄生于宿主红细胞表面、血浆及骨髓等处引起的一种以发热、黄疸、贫血为主要临床特征的人畜共患传染病(Kreier等,1976).附红细胞体在<伯杰细菌鉴定手册>中列为立克次体目,无浆体科,附红细胞体属(Gwaltney等,1995).近几年对猪附红细胞体病原基因进行序列分析研究认为,猪附红细胞体应更名为猪嗜血性支原体或猪支原体.     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原，用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗．建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测方法。结果显示，用PPA-ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体，具有很高的敏感性和特异性，重复性良好．完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

猪附红细胞体50S核糖体基因PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上最新发布的猪附红细胞体基因组序列(NC-015155)设计一对引物,并以吉林省延边地区猪附红细胞体基因组DNA为模板,建立猪附红细胞体50 S核糖体基因PCR诊断方法,通过特异性、敏感性及临床应用试验验证,快速准确的检测出猪附红细胞体.试验结果显示,建立的猪附红细胞体PCR诊断方法扩增片段大小为10...     

猪附红细胞体膜蛋白OxaA基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪附红细胞体膜蛋白OxaA的结构及其在免疫保护中的功能,根据GenBank上发表的猪附红细胞体(猪支原体NC_015153.1)全基因组序列中膜蛋白OxaA基因,对猪附红细胞体膜蛋白OxaA基因进行PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果:PCR扩增基因全长840 bp,编码279个氨基酸,与GenBank(NC_015153.1)中对应序列同源性为98%,测序结果已提交GenBank(登录号为JN247625);生物信息学软件分析表明,膜蛋白OxaA是稳定型亲水性的蛋白,柔性区域呈散在性分布,以α-螺旋为主,主要有3个抗原表位区域。     

抗猪附红细胞体单克隆抗体的制备和鉴定

为了制备特异的抗猪附红细胞体单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb),将纯化的猪附红细胞体抗原浓缩后免疫6周龄BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术制备MAb。制备的MAb分别通过抗体亚类试剂盒、Western blot进行单抗亚类和特异性检测。结果显示,共获得了2株能稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株,命名为3F7和2C4。2株MAb的亚型均为IgG2a,其腹水效价分别可达1:16 000和1:14 000。特异性检测表明,2株MAb均能特异性地与猪附红细胞体结合,而与弓形虫、猪链球菌、猪肺炎支原体和猪繁殖与呼吸综合症病毒均无反应。2株MAb的获得有望为猪附红细胞体病的诊断和防治提供新的材料。     

羊附红细胞体抗原的提取及免疫性分析

自1934年Neitz等发现并命名了羊附红细胞体(E.ovis)以来,羊附红细胞体已被公认为是致病性较强的一种病原体。目前,国内外对附红细胞体病的研究已取得了一定进展[1-2],但对羊附红细胞体抗原的研究尚少,至今尚无羊附红细胞体抗原免疫性分析的报道。试验对体外分离培养的羊附红细胞体经反复冻融、超声波裂解后,应用SDS-PAGE电泳及免疫印迹技术进行了免疫性分析,以期为羊附红细胞体病的深入研究提供依据。1材料与方法1.1材料RPM I-1640培养液(RPM IMed ium 1640)、M-199培养液(Med ium 199)、兔抗绵羊IgG-HRP,均购于北京华美公司;蛋白…     

羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

为快速准确诊断和检测羊附红细胞体病,及时采取防治措施,建立了检测羊附红细胞体抗原的双抗夹心ELISA诊断方法。选取规模化养殖场羊,镜检附红细胞体红细胞感染率> 90%,无菌采取血液,分离羊附红细胞体抗原,制备纯化兔抗羊附红细胞体抗体,应用辣根过氧化物酶标记抗体,进行双抗体夹心ELISA试验。试验结果表明,双抗体夹心ELISA方法的最佳工作条件为:抗体最佳包被量为82.91 μg/mL,酶标抗体最适工作浓度为1∶400,抗原最低检出量为7.81 μg/mL;而且与支原体、大肠杆菌、葡萄球菌以及牛、猪、兔附红细胞体均不出现交叉反应,表明该方法具有良好的特异性,可用于羊附红细胞体病的诊断和群体检测。     

Establishment of an efficient enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Eperythrozoon sius antibody in swine

The Eperythrozoon suis (E. suis) antigen was purified using a Sephadex G-200 chromatograph, and thereby, a high-affinity, specific E. suis antigen was collected and confirmed with Western blotting. Using this antigen, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) system to detect the antibody against E. suis in swine was established. There was no cross-reaction with swine sera, which were affected with Mycoplasmal pneumonia, swine fever, swine colibacillosis, or toxoplasmosis. A comparison of this ELISA system with an indirect hemagglutination (IHA) test using 78 swine samples revealed that the ELISA system significantly improved the sensitivity, specificity, and stability for the serodiagnosis of swine E. suis.     

猪附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

从确诊为猪附红细胞体感染的猪场，无菌采集血样，抽提猪附红细胞体基因组DNA，采用真细菌的通用引物进行16S rRNA基因扩增，对扩增产物进行克隆和测序。从3个地理位置不同的猪场均成功地扩增出长度为1469bp的核苷酸序列。系统进化分析表明，3个猪场样品所测序列一致性达99．52％以上，具有相同的基因型，但与国外报道的猪附红细胞体Illinois株同源性为95％，属于同一基因群，但基因型不同；所有种类的附红细胞体和血巴尔通氏体组成同一进化分支，这类血营养菌与支原体科，支原体属的病原最靠近(75％)，而与立克次氏体目的病原较远(70％)。上述研究证实，广东所流行的猪附红细胞体是一种新基因型的猪附红细胞体，建议命名为猪附红细胞体广东株型；为反映进化关系，猪附红细胞体和其它血营养菌应划归于支原体科的支原体属。     

猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。     

猪附红细胞体SRP54基因的克隆及真核表达质粒的构建

为了研究猪附红细胞体信号识别颗粒54（SRP54）基因的功能,试验根据GenBank上发表的猪附红细胞体KI₃806全基因组序列（登录号为NC₀15153.1）中信号识别颗粒（SRP）蛋白基因设计合成1对特异性引物,采用PCR方法扩增猪附红细胞体SRP54基因片段,将扩增产物克隆至pMD18-T载体上,重组质粒经PCR和酶切鉴定后测序,并将SRP54基因与pVAXⅠ真核表达载体连接。结果表明:克隆的SRP54基因片段长1 173 bp,与GenBank中原序列同源性为97%,构建的真核表达质粒pVAXⅠ-SRP54经PCR和酶切鉴定正确,为猪附红细胞体SRP54基因的后续研究奠定了基础。     

Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Eperythrozoon suis antibodies in swine.

An ELISA was developed and tested to detect antibodies to Eperythrozoon suis in swine. Results were compared with those of the indirect hemagglutination (IHA) test. Antigen isolated from swine heavily infected with E suis was used for both tests. Comparison of the ELISA with the IHA test revealed a significant (P less than 0.001) correlation between results. Of 114 samples obtained from 9 swine infected with E suis, 87.7% were seropositive (titer greater than or equal to 200) via the ELISA, and 80.7% were seropositive (titer greater than or equal to 20) via the IHA test. The sensitivity of the ELISA was greater than that of the IHA test. All blood samples obtained from specific-pathogen-free swine tested negative for E suis antibody. Cross-reactions were not observed between E suis antigen and antisera against various swine and cattle disease agents using ELISA. We concluded that the ELISA may be used for rapid and effective diagnosis of infection with E suis in swine.     

抗附红细胞体有效药物的筛选

以PCR检测附红细胞体呈现阳性，且镜检染虫率达909／5以上的猪血样为研究对象，选择几种附红细胞体敏感的药物(血虫净，附红净，庆大霉素，博士914，土霉素，三毒清，红弓链914，附红120，红弓链克，乌金土霉素)和对支原体敏感的恩诺沙星，对立克次氏体敏感的红霉素，采用两种方法进行体外药效试验。附红净对附红细胞体的作用效果最明显，而庆大霉素对附红细胞体基本无效，其他药物对附红细胞体也有一定杀灭效果。     

牛附紅细胞体解离方法的比较

为建立一种较好的牛附红细胞体解离方法,我们对同一感染附红细胞体牛的血液样本,应用三种方法对牛附红细胞体进行了解离。通过显微镜检查及测定蛋白质浓度比较其解离效果。结果表明,体外培养解离法效果最好,化学试剂法次之,而水浴法解离下的牛附红细胞体数量最少,但附红细胞体的运动性较强。本试验为进一步研究牛附红细胞体的生物学特性及抗原分析奠定了基础。     

Recombinant DNA probe detecting Eperythrozoon suis in swine blood

A genomic library to Eperythrozoon suis DNA was constructed in lambda gt11, and from this library, E suis clone KSU-2 was identified as a potential diagnostic probe. In hybridization experiments that used 100-microliters samples of blood collected in chaotropic salt solutions, the KSU-2 probe hybridized strongly with purified E suis organisms and blood samples from splenectomized swine that were parasitized with E suis. However, the probe under stringent conditions did not give radiographic indications of hybridizing with equine blood DNA, bovine blood DNA infected with Anaplasma marginale, canine blood DNA infected with Ehrlichia canis, feline blood DNA infected with Haemobartonella felis, or uninfected swine blood DNA.     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用

基于猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的序列特点，设计合成种特异性引物，建立了猪附红细胞体PCR检测方法。该方法能特异性扩增523bp的猪附红细胞体16SrRNA基因片段，而对猪丹毒杆菌G4T10株、猪链球菌STl71株、多杀性巴氏杆菌E0630株、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、鸡毒支原体和猫血巴尔通氏体CA株的基因组DNA没有扩增带出现。对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为160pg。通过对38份临床样品的检测，8份为猪附红细胞体感染阳性，其余为阴性。结果表明，建立的PCR检测方法具有极高的敏感性和特异性，可用于急性猪附红细胞体病和临床健康带菌猪的诊断。