转OsDREB3基因大豆外源基因拷贝数的确定及标准分子的构建

为建立抗逆转OsDREB3基因大豆快速稳定的品系特异性检测方法,本试验通过实时Real-time PCR方法,以大豆凝集素基因(lectin)作为内源参照基因,确定了外源基因OsDREB3在转OsDREB3基因大豆基因组中的拷贝数为单拷贝,为建立快速、有效的品系特异性检测方法奠定基础.同时,在原有构建的含4种转基因大豆品系特异性序列的标准分子载体上又增加了转OsDREB3基因大豆品系特异性序列,新构建了含有5种转基因大豆品系特异性序列的标准分子及大豆内参照基因(lectin),已完全满足对现有国内覆盖面最大的5种转基因大豆同时、快速筛查检测工作的需要.     

GTS40-3-2大豆转化体特异性的定性PCR检测

为了建立转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法,本研究根据已公布的转基因大豆GTS40-3-2的旁侧序列信息,用Primer 5.0软件在左右边界的结合位点处设计了5对引物组合,选取扩增片段为370 bp最佳引物组合后,优化了反应体系中引物浓度和退火温度.以Lectin为内标基因,验证检测引物的特异性及灵敏度,建立了转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法.结果表明,该方法成本低、效率高,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,已通过全国六家实验室的循环验证,能特异地检测大豆样品中GTS40-3-2转化体,最低限可达0.05％.研究表明,该方法满足我国转基因生物安全管理过程中对GTS40-3-2大豆的检测需求,具有良好的应用前景.     

PCR检测转基因大豆

［目的］定性检测转基因大豆。［方法］以非转基因大豆和CP4-EPSPS转基因大豆为材料,以大豆内源基因Lectin和外源基因5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（CP4-EPSPS）为检测的目的片段,建立PCR反应体系。采用改进CTAB法提取大豆基因组DNA,并对所提DNA进行PCR扩增和电泳检测,确定转基因大豆的PCR检测限。［结果］改进CTAB法提取的大豆基因组DNA电泳条带清晰完整,转基因大豆和非转基因大豆基因组DNA均可扩增出约409 bp的条带即Lectin基因,而只在转基因大豆中检测出CP4-EPSPS特异性片段;当转基因大豆的含量为100%～0.2%时,均可扩增出特异性条带。［结论］该研究建立了转基因大豆的PCR检测方法。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计特异性引物进行PCR检测,并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1142bp的3′端旁侧序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性从MON89788大豆中扩增出170bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文）

[目的]建立MON89788大豆转化体特异性定性PCR检测方法。[方法]利用TAIL-PCR技术分离MON89788大豆的3′端旁侧序列,据此序列设计3条特异性引物用于旁侧序列的扩增。经过3轮PCR扩增,获得特异性扩增产物,将此产物回收后克隆到pMD-18T载体上测序,所得序列用Vector NTI分析,并提交NCBI进行序列比对。并对该方法的特异性和灵敏度进行测试。[结果]获得了1 142 bp的3′端旁侧序列。经Blast检索比对,该序列包括2部分,1 ～618 bp为载体序列（E9终止子部分序列和LB序列）,619 ～1 142 bp为大豆基因组序列;依据该序列建立的PCR检测方法能特异性地从MON89788大豆中扩增出170 bp的产物,检测灵敏度达到0.05%,约为40个起始模板拷贝。[结论]该研究建立的方法特异性强、灵敏度高,可适用于MON89788大豆检测。     

转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光定量PCR检测方法建立

[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。     

口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系定量PCR检测方法

以我国口岸重点监控的转基因棉花T304-40品系为研究对象,根据其外源插入片段与基因组DNA3'端邻接区序列设计引物和探针,经筛选和优化后,建立了转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR检测方法。对方法的适用性测试结果表明,建立的实时荧光定量PCR检测方法高度特异于转基因棉花T304-40品系检测,反应效率达94.2%,绝对灵敏度为20拷贝基因组DNA,定量下限为25拷贝基因组DNA。以研制的检测方法建立标准曲线对盲样进行定量分析,结果表明4个盲样的测定值与设定值间的偏差均小于10%。因此,本研究建立的转基因棉花T304-40品系特异性实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可准确地对棉花及其制品中转基因棉花T304-40成分进行定性或定量检测分析。     

转基因玉米NK603品系成分LAMP快速PCR检测方法的建立

根据转基因玉米品系NK603外源插入片段与玉米基因组序列设计品系特异性引物,建立转基因玉米品系NK603的品系特异性环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对此方法进行灵敏度、特异性测试。试验表明该方法能够快速检测出转基因玉米NK603品系成分,检测灵敏度为0.1%,并具有较高的特异性和较好的稳定性。     

耐除草剂转基因大豆质粒标准分子的构建

以A2704-12、A5547-127、MON89788和GTS-40-3-2等4种商品化耐除草剂转基因大豆为材料,构建质粒标准分子用于解决转基因作物检测时标准物质缺乏现状。采用双酶切技术,将扩增的大豆内参基因和耐除草剂转基因大豆转化体特异性片段克隆至pMD18-T载体上。结果显示,质粒标准分子定性PCR特异性序列片段的LOD均为20copies/μL,定量检测体系Bias最大值≤9.89%,CV最大值≤5.96%,SD最大值≤0.06,实验得到的所有偏差值均在允许范围之内,构建的质粒标准分子适用于4种耐除草剂转基因大豆特异性检测。     

转基因抗虫大豆MON87701品系实时荧光PCR检测方法的建立

建立Taq Man实时荧光PCR反应检测转基因抗虫大豆MON87701品系的鉴定方法,为转基因大豆MON87701提供科学的检测依据。根据转基因抗虫大豆MON87701品系特异基因序列设计引物和Taqman探针,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果表明,本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏度可达到0.01%(m/m),检测重复性好。因此,建立的转基因大豆MON87701品系特异Taq Man实时荧光PCR检测方法可快速、准确地鉴定转基因抗虫大豆MON87701品系,可在日常检验中推广应用。     

转基因香石竹Moonlite品系特异性定性PCR检测方法的建立

以转基因香石竹品种Moonlite(月之伊人)为研究对象,通过TAIL-PCR方法,获得外源基因插入位点的左侧旁邻序列。根据旁邻序列设计引物,建立品系特异性定性PCR方法,其扩增片段覆盖了转化载体及香石竹基因组临界序列。本方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确、高效地检测转基因香石竹Moonlite品种。     

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆cp4-epsps基因上的应用

以转基因抗草甘膦大豆为主要研究对象,利用环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP),针对cp4-epsps合成酶基因(5-enolpyruvlshimimate-3-phosphate synthase)的6个区域设计4条特异性引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase),在65℃保温30 min,通过荧光显色即可完成对转基因的检测工作。结果显示,该LAMP方法能够特异性检测cp4-epsps基因,其检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍。建立了针对转基因大豆cp4-epsps基因的LAMP检测方法,其具有高度的特异性及稳定性,结果可靠,适合转基因抗草甘膦大豆的快速检测。     

转基因植物及其产品PCR检测引物的筛选研究

建立了一种转基因植物及其产品PCR检测引物筛选方法。以转基因大豆Roundup Ready为材料,设计了5对引物,通过荧光定量PCR方法对其扩增产物的Ct值、引物与模板的结合效率、PCR产物的溶解曲线方面进行分析,证明RRS2引物对是转基因大豆Roundup Ready最佳品系特异性检测引物。     

RNAi干扰的F3H基因转化大豆的研究

利用根据RNAi技术构建的干扰黄烷酮-3-羟化酶基因(F3H)的载体pF3Hi330,通过农杆菌介导辅助抽真空的大豆茎尖转化法和花粉管通道法将pF3Hi330载体整合到大豆基因组中,获得转基因阳性植株4棵,抗性植株经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到大豆基因组中。同时,对转基因阳性植株异黄酮含量进行测定,显示异黄酮含量得到一定的提高。结果表明更多的前体流向异黄酮合成的分支途径,达到提高大豆异黄酮含量的目的。     

TAIL-PCR研究进展及其在畜牧兽医中的应用

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)是一种以PCR为基础的染色体步移,主要用于分离已知基因的侧翼序列,具有简便、快速、高效、特异性强等特点.文章从TAIL-PCR的原理、优势及局限性、反应体系优化等方面对TAIL-PCR的研究进展进行综述,其中在畜牧兽医中主要用于已知基因侧翼克隆和转基因动物模型外源基因插入位点确定.但由于基因组DNA的庞大和复杂性,使得从基因组中克隆获得目的基因仍存在诸多限制因素,如特异性引物错配和随机引物结合位点不确定,易造成非特异性产物的产生;模板GC含量异常或存在高度重复序列时,即使使用多种简并引物也难以获得阳性产物.因此,应根据实际情况对TAIL-PCR进行灵活调整.当模板较复杂时,可借鉴连接介导PCR原理,给引物加上接头,提高扩增反应的特异性;当模板较简单或序列较清晰时,可根据模板特点(如高GC含量)或已知模板序列设计引物、调整反应条件,增加操作的简便性;还可参考Suppression-PCR原理,选择引物和反应条件,获得较长的扩增片段.此外,TAIL-PCR可与多种技术联合使用,促使其在畜牧兽医中获得更广泛深入的应用.