龙眼胚性培养物高分辨率蛋白质双向电泳技术

试验以龙眼胚性培养物为材料,通过对小型垂直板双向电泳和固相pH梯度凝胶双向电泳比较分析,进行龙眼胚性培养物高分辨率蛋白质双向电泳技术方法的研究.结果表明,采用固相pH梯度凝胶双向电泳可以极大地提高分辨率,相同龙眼胚性培养物的蛋白样品染色后所得的蛋白质谱点数从334左右增加到810左右;由于龙眼胚性培养物的蛋白等电点集中在3.5-7.0之间,采用13 cm的IPG胶条时,以pH 4-7的IPG胶条分离蛋白的效果佳.     

龙眼胚性培养物蛋白质水平双向电泳技术体系的建立

以龙眼胚性培养物为材料,使用Pharmacia多功能水平电泳仪(Multiphor ),采用滤纸半干电泳与梯度凝胶技术,建立了适合于龙眼胚性培养物的蛋白质水平双向电泳技术体系.使用该技术有望对龙眼体细胞胚胎发生过程中特异蛋白进行研究.     

金鱼胚胎蛋白质双向凝胶电泳方法建立及优化

以金鱼胚胎为材料,以不同样品制备方式、裂解液成分、固相pH梯度胶条的选择、凝胶浓度为侧重点,建立并优化金鱼胚胎总蛋白质组最佳双向凝胶电泳技术条件.研究表明,采用匀浆器匀浆含硫脲和NP-40裂解液提取蛋白,应用pH值为3～10的非线性IPG胶条和浓度14%的SDS-PAGE凝胶进行双向电泳,经优化电泳电流、时间等参数后,获得了重复性和分辫率理想的金鱼胚胎总蛋白质双向电泳图谱,为金鱼胚胎蛋白质组分析莫定了基础,为揭示金鱼单倍体发育异常的机制提供了技术保障.     

两种固相pH梯度胶条对桃果实蛋白质双向电泳的影响

为完善用于蛋白质组分析的双向电泳体系,以"久保"桃中果皮为试材,比较pH 5.0～8.0与pH 3.0～10.0线性范围的固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)胶条对蛋白质双向电泳的影响。结果表明:采用pH 5.0～8.0的17 cm胶条,90μg蛋白上样量,等电聚焦(IEF)电泳后,进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),银染色得出的双向电泳图有蛋白点(1 318±125)个,图谱背景清晰效果较好,适用于桃中果皮蛋白质组分析。     

不同pH梯度的IPG胶条对绿竹叶片蛋白双向电泳的比较

双向电泳(2-DE)技术是研究蛋白组学的有效途径和重要手段,而在双向电泳第一向中使用不同pH梯度的IPG胶条,是对双向电泳技术研究的深入。利用改良的TCA/丙酮与Tris-饱和酚提取法,提取纯度更高的绿竹叶片全蛋白,并在双向电泳中使用不同pH梯度的IPG胶条,检测其对绿竹叶片双向电泳图谱的影响。结果表明,蛋白样品上样量为20μg时,在7 cm的pH3-10L、pH3-10NL、pH5-8L 3种胶条中,pH5-8L的胶条在双向电泳的凝胶图谱上显现的蛋白点数目最多,约有400个,而且蛋白点的分布较其他2个胶条的结果更为均匀,清晰度更高;pH3-10NL的胶条的图谱上显现的蛋白点要比同一跨度的pH3-10L的胶条更多;通过3种胶条的对比可以使绿竹叶片双向电泳的分辨率显著提高。对于在pH5-8L显现出来的4个蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱分析,成功鉴定出4个蛋白点,其中3个蛋白点在pH3-10L胶条的双向电泳中是没有显现出来的,这些蛋白对于植物生物功能的发挥具有意义。试验表明了对于一些低丰度蛋白及小分子量蛋白的检测和鉴定,可以利用pH梯度较小的固化胶条进行双向电泳试验。     

仁用杏‘围选1号’雌蕊总蛋白双向电泳体系的建立

为了建立一套适合仁用杏‘围选1号’雌蕊蛋白质分析的双向电泳系统,对总蛋白质的提取方法、SDS-PAGE凝胶浓度、上样量、IPG胶条梯度进行了优化。优化的条件为:酚-甲醇/醋酸铵沉淀法提取总蛋白质,浓度为12%的SDS-PAGE凝胶,24cm pH 4～7的IPG胶条,上样量100μg,采用该体系能获得图像清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,基本满足仁用杏‘围选1号’雌蕊蛋白质的分析和研究。     

甜瓜叶片蛋白质2 DE中IPG胶条及染色方法的选择

研究双向电泳中IPG胶条对甜瓜叶片中的蛋白质在2 DE图谱上的影响，以及双向电泳后凝胶的最适染色方法。结果表明：当上样量为300 μg时，在pH 3～10 L（pH为3~10，线性）、pH 3～10 NL（pH为3~10，非线性）和pH 4～7 L（pH为4~7，线性）3种IPG胶条中，pH 4～7 L的IPG胶条在2 DE胶上出现的蛋白点数最多，大约为648个，且分布均匀，清晰度较高；pH 3～10 NL的IPG胶条在图谱上出现的蛋白点数要稍多于pH 3～10 L的IPG胶条。凝胶染色结果说明，银染 考马斯亮蓝复合染色法效果最好，可明显提高蛋白质凝胶电泳的分辨率。     

稻瘟菌胞外蛋白的提取及电泳方法初探

利用蛋白质组学研究方法对稻瘟菌的胞外蛋白进行分析,可以更好地了解该病原菌的生物学特性和致病机制.蛋白质样品制备和双向电泳,都是蛋白质组学研究的基础.采用冷冻干燥,透析结合法与三氯乙酸-脱氧胆酸钠沉淀法(TCA-DOC沉淀法)提取液体培养稻瘟菌得到的胞外蛋白,利用17 cm pH 3.0～10.0与17 cm pH 4.0～7.0两种pH梯度IPG胶条对同一样品进行第一向等电聚焦,12%SDS-PAGE凝胶进行第二向电泳,银染后用PDQuest软件(V7.4)对电泳图谱进行分析.结果表明,在上述两种提取稻瘟菌胞外蛋白的方法中,TCA-DOC沉淀法具有较好的提取效果,应用该实验方法得到的蛋白质分布在pH 4.0～7.0之间的点数达到621个,因此在双向电泳中,采用pH 4.0～7.0的胶条具有较好的分辨率.     

稻瘟茵胞外蛋白的提取及电泳方法初探

利用蛋白质组学研究方法对稻瘟菌的胞外蛋白进行分析,可以更好地了解该病原菌的生物学特性和致病机制。蛋白质样品制备和双向电泳,都是蛋白质组学研究的基础。采用冷冻干燥,透析结合法与三氯乙酸-脱氧胆酸钠沉淀法（TCA-DOC沉淀法）提取液体培养稻瘟菌得到的胞外蛋白,利用17cm pH3.0-10.0与17cm pH4.0-7.0两种pH梯度IPG胶条对同一样品进行第一向等电聚焦,12％ SDS-PAGE凝胶进行第二向电泳,银染后用PDQuest软件（V7.4）对电泳图谱进行分析。结果表明,在上述两种提取稻瘟菌胞外蛋白的方法中,TCA-DOC沉淀法具有较好的提取效果,应用该实验方法得到的蛋白质分布在pH4.0-7.0之间的点数达到621个,因此在双向电泳中,采用pH4.0-7.0的胶条具有较好的分辨率。     

梨叶片总蛋白提取及双向电泳体系的建立

【目的】探索建立有效的梨叶片蛋白质组双向电泳体系,为梨蛋白质组的后续研究提供参考。【方法】以早酥梨叶片为材料,比较蛋白质提取方法、蛋白质裂解时间、IPG胶条的pH梯度和长度、等电聚焦程序及SDSPAGE电泳参数对梨叶片蛋白双向电泳结果的影响。【结果】采用第2种改良的三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取梨叶片总蛋白,蛋白质裂解1 h,选用长17 cm、pH 4～7的IPG 胶条及聚焦程序Ⅱ进行等电聚焦,于100 V 30 min、180 V 6 h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适用于梨叶片蛋白质组分析的双向电泳体系。     

茭白线粒体蛋白双向电泳体系建立

[目的]建立适合于茭白线粒体蛋白质组分析的双向电泳技术体系,为进一步开展茭白线粒体差异蛋白质组学研究提供参考.[方法]以茭白为试验材料,比较不同线粒体提取纯化方法、IPG胶条pH范围及蛋白上样量等条件对双向电泳图谱的影响.[结果]差速离心(3000~14000×g)联合Percoll不连续密度梯度离心(20%∶24%∶40%=2∶4∶2)对茭白线粒体的提取纯化效果优于仅采用差速离心.采用改良酚抽法提取茭白线粒体蛋白,17 cm、pH 3~10的IPG胶条,1.0 mg上样量,12% SDS-PAGE进行双向电泳,0.12%考马斯亮蓝G-250胶体考染法染色,茭白线粒体蛋白主要分布在pH 4~8范围内,pH 3~4和pH 8~10范围内蛋白点较少;进一步选用pH 4~7和pH 5~8的IPG胶条对茭白线粒体蛋白进行双向电泳,分离效果均明显提高,且pH 4~7范围内IPG胶条的双向电泳图谱清晰,蛋白点分辨率较高.分别采用0.8、1.0和1.2 mg 3个不同的上样量进行双向电泳,结果表明上样量为1.0 mg时,电泳图谱质量最好.[结论]通过差速离心联合Percoll不连续密度梯度离心提取纯化茭白线粒体,并控制好双向电泳体系的pH范围、上样量等因素,可获得蛋白质点清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼(Dimdcarpus longanaLour.)种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。     

适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳优化体系的建立

[目的]建立适于番茄叶片蛋白质组分析的双向电泳(2-DE)技术,为开展番茄蛋白质组学研究奠定技术基础.[方法]对番茄叶片蛋白质提取方法、蛋白质裂解液、上样量、胶条pH范围等关键步骤进行优化.[结果]采用三氯乙酸／丙酮法提取番茄叶片总蛋白质,含有7 moL/L尿素,2 mol/L硫脲,4; CHAPS,30 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)裂解缓冲液,上样量为100 mg,以pH 4 ～7、18 cm的IPG胶条在12; SDS-PAGE凝胶浓度下进行双向电泳,得到了蛋白点均匀分布、低峰度蛋白点较为清晰,蛋白点数目多且分辨率高的2-DE图谱.[结论]建立了一套适于番茄叶片蛋白质分析的双向电泳技术体系,为下一步在蛋白组学水平上分析番茄逆境胁迫等相关蛋白提供了技术支持.     

锥栗果实双向电泳体系的建立

通过对传统双向电泳技术进行改进和优化,包括对锥栗果实蛋白不同提取方法的优化和不同pH值范围IPG胶条的比较等,以建立适于锥栗果实蛋白质组分析的双向电泳方法.结果表明,使用裂解液直接提取蛋白的方法所获得的双向电泳图谱稳定性和重复性较好,分辨率较高,经银染后可分辨出400多个蛋白点,其等电点主要分布于pH 4-7.     

鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的优化

为探索适用于鸳鸯茉莉花瓣蛋白质双向电泳技术的方法,采用酚抽提取法对IPG胶条及蛋白质上样量等关键步骤进行优化。结果显示,鸳鸯茉莉花瓣蛋白质在p H值为4.0-7.0,24 cm IPG胶条范围分离效果较好,并且当上样量为1.5 mg时,在双向电泳图谱上检测到的蛋白点较多且清晰,分辨率较好。     

天女木兰种子蛋白双向电泳体系的建立

【目的】探索一套适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系,为研究其种子萌发过程中的蛋白表达差异奠定基础。【方法】比较蛋白的不同提取方法(酚提取法、三氯乙酸-丙酮-酚提取法、三氯乙酸-丙酮法和Tris-HCl法)、IPG胶条pH梯度(pH3～11NL、pH3～10和pH4～7)、裂解液中的尿素浓度(6,7,8,9mol/L)和分离胶浓度(10%和12.5%)等条件,对天女木兰种子蛋白双向电泳结果的影响,筛选适宜的双向电泳条件。【结果】以Tris-HCl法提取种子蛋白,在IPG胶条pH为4～7、裂解液中尿素浓度为9mol/L、分离胶浓度为12.5%的条件下,可以获得分辨率高、背景清晰、重复性好的天女木兰种子蛋白双向电泳图谱。【结论】建立了适用于天女木兰种子蛋白的双向电泳体系。     

利用双向电泳技术分离野牛草叶片蛋白的方法研究

制备野牛草叶片蛋白质样品,对双向电泳条件等技术环节进行优化,以期获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱,建立适应野牛草叶片蛋白组学研究的技术平台,并对其蛋白组进行初步分析。采用TCA/acetone沉淀法和Trizol沉淀法分别提取野牛草叶片蛋白,通过不同聚焦时间分离,最终经硝酸银染色,以Imagemaster 2D Platinum V 5.0图像分析软件对所得的双向电泳图谱进行分析比较。对获得的最佳图谱进行蛋白点分布分析,选择最适合的胶条pH值。结果表明:Trizol沉淀法提取蛋白样品,总聚焦伏时数在8~10万V.h间,为最适合条件,获得图谱背景清晰,纵横纹少,蛋白点分离较完全,在pH3~10胶条凝胶可检测到的蛋白质点达到800个。对蛋白点pH分布范围分析表明,85%蛋白点分布在pH4~7之间,选择pH4~7的IPG胶条,能检测到1 000个以上的蛋白点。以Trizol沉淀法结合优化的双向电泳参数对野牛草叶蛋白组进行双向电泳分离,获得了高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱,可用于野牛草差异蛋白质组学研究。     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.     

果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立

以果梅花芽为材料,比较了TCA/丙酮法和酚抽法2种总蛋白质提取方法对蛋白质双向电泳(2-DE)的影响,同时对IPG胶条种类、凝胶浓度、蛋白质上样量及染色方法等环节进行了优化.结果表明:TCA/丙酮法比酚抽法在2-DE凝胶图谱上的蛋白质点数增多,图谱背景也比较清晰,没有明显的纵横条纹;采用17 cm pH 4～7的胶条、10％的凝胶浓度、1.5～1.8 mg的蛋白质上样量,经改良胶条考马斯亮蓝G-250染色后可获得背景清晰、重复性好、蛋白质分辨率高的2-DE图谱.高质量的果梅花芽蛋白质提取方法和蛋白质双向电泳体系的优化可为果梅蛋白质组学研究奠定技术基础.     

菜籽蛋白质组双向电泳技术体系的优化研究

[目的]建立适用于菜籽蛋白质组研究的双向电泳技术。[方法]以湘油17号为材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、凝胶浓度、上样量等条件进行了优化。[结果]使用TCA一丙酮法提取菜籽总蛋白最佳,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数最多。当采用pH3～10IPG胶条和12％的凝胶、上样量为250μg时,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。[结论]为开展油菜种子蛋白质组学研究奠定了基础。