不同血清浓度对小鼠骨髓巨噬细胞原代培养的影响

为了探讨在相同试验条件下,培养基中不同血清浓度对小鼠骨髓巨噬细胞原代培养增殖分化的影响,不同培养时间(3 d、6 d、9 d)条件下,对不同血清浓度(5%、10%、20%、40%)培养基培养的细胞进行细胞形态学、增殖生长曲线的对比研究。结果表明:不同血清浓度的培养基对小鼠骨髓巨噬细胞的生长曲线和细胞学形态均有影响。说明10%、20%血清浓度的培养基中细胞形态完整、折光性高,存活率相对较高且稳定,细胞增殖明显,且数量较多,但20%血清浓度组中细胞增殖更明显,是其中最适宜的原代培养骨髓巨噬细胞的血清浓度。     

不同血清浓度对小鼠肺细胞原代培养的影响

为了比较不同血清浓度的培养基对小鼠肺细胞原代培养的影响,在常规RPMI 1640培养基的基础上添加不同浓度的新生牛血清(5%、10%、20%、40%),每隔1 d在倒置显微镜下观察培养细胞的形态并用台盼蓝染色法统计细胞数目,绘制生长曲线。结果表明:4个血清浓度组中均有原代肺细胞生长增殖,血清浓度为10%的培养液培养的细胞生长状况最好,细胞形态完整清晰,数量较多,更适合小鼠的肺细胞生长。说明10%血清浓度的培养液最适合小鼠肺细胞的原代培养。     

不同血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响研究

试验研究了不同血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外生长的影响,初步确定体外培养的适宜血清浓度。采用组织块贴壁培养法在不同血清浓度的培养基中进行条件培养(体积分数为5%、10%、15%),观察细胞形态,采用MTT法进行细胞增殖试验。结果表明,含10%、15%血清培养液相对于含5%血清培养液条件下,细胞从组织块迁移出来的时间较短,培养成纤维细胞生长、增殖迅速,细胞活力较强,MTT值明显增高(P0.05),而10%血清与15%血清比较,则差异不显著(P0.05)。     

从小鼠类ES细胞分化群中分离培养一类衍生细胞及其培养特性

将小鼠囊胚在饲养层、无类LIF因子的培养基中培养出类ES细胞团,将该类ES细胞团传至第三代,暂停传代,继续培养,则4～5 d后该细胞团会向周围分化出一种圆而发亮的衍生细胞,该衍生细胞会不断地向周围生长,约20 d后该衍生细胞铺满培养皿底.将该衍生细胞传至铺有饲养层的培养瓶中继续传代至第七代,再将其传代至无饲养层的培养瓶中,约12 d后,其在无饲养层的培养瓶中长满瓶底.以后随着传代数的增加,该细胞长满瓶底所需时间越来越短,最后稳定在2～3 d.对传代至第30代的细胞进行生长曲线测定,并以不同的基础培养基、不同的血清浓度、不同的胰岛素浓度等条件培养该细胞,结果发现：该衍生细胞分别在DMEM高糖、DMEM低糖、DMEM-F12、PRMI1640等为基础的培养基中都能生长,但以DMEM-F12为最优.在血清浓度分别为10%、14%、18%的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在高浓度血清的培养基中具有生长更好的趋势.在胰岛素浓度分别为0、0.25、0.5、1 μg/ml的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在无胰岛素的培养基中无法正常生长,在0.5 μg/ml胰岛素浓度的培养基中生长最佳.     

血清浓度对共培养条件下牛原代肌肉卫星细胞及前体脂肪细胞活性影响

为探索添加血清浓度对共培养条件下细胞活性的影响,本研究采集新生秦川犊牛背最长肌和肾周脂肪,分离提取前体脂肪细胞和肌卫星细胞,建立以DMEM/F12培养基,不同细胞混合比例(肌肉细胞:脂肪细胞=10:1、5:1、2:1)的多种共培养体系,通过调整各共培养体系培养基中的胎牛血清比例(5%、10%、15%、20%的胎牛血清,FBS),来研究血清浓度对各共培养体系中细胞活性的影响。共培养14d,每两天更换对应培养基,并采用MTT染色法测定共培养细胞的细胞活性。统计分析后发现:共培养细胞活性随着血清浓度的上升而增加;15%FBS和20%FBS浓度下细胞活性均显著高于5%FBS组和10%FBS组(P<0.05);虽20%FBS组细胞活性高于15%组,但差异不显著(P>0.05)。综上,为了获得最好的牛肌卫星细胞和前体脂肪细胞共培养效果,达到较高的细胞培养活性,建议采用15%(v/v)以上的FBS进行共培养。     

两种鼠血清与两种培养基对PK15细胞培养的比较

为比较研究DMEM培养基和RPMI-1640培养基对PK15细胞的培养效果,选择效果好的作为基础培养基,用大鼠血清和小鼠血清分别以不同量添加进行培养,用细胞显微病变(CPE)观察法和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法测定其对细胞生长的影响,为血药试验选择试验动物提供依据。结果表明:DMEM培养基较RPMI-1640培养基对PK15细胞的培养效果好,加5%大鼠血清或2.5%小鼠血清配制DMEM培养基的培养,对PK15细胞的培养生长无副作用,即两种血清的无毒安全浓度分别为5%和2.5%。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶+0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P>0.05),但明显高于其他处理组(P<0.01)。     

鸡肝癌细胞系LMH培养特性的研究

为探索鸡肝癌细胞系LMH的生长特性,对LMH细胞复苏、冻存、传代、培养温度、培养基种类和血清含量等进行了研究。结果显示:LMH细胞系培养最佳温度为37℃,培养基为高糖DMEM或F12培养基,培养液中最佳血清含量含10%胎牛血清,细胞传代的最佳接种浓度为3.0×10~5个/mL,细胞连续传代后细胞形态和培养特性未发生变化。研究结果为LMH细胞系的大规模培养提供了有利的技术支撑。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

低血清培养PK-15细胞及其增殖猪圆环病毒2型的研究

依次采用含60、30、20、10mL/L血清浓度的低血清培养基驯化PK-15细胞,并给驯化好的细胞上接种猪圆环病毒2型(PCV-2),以确定PCV-2在该培养体系下的生长情况。结果用含60、30、20mL/L血清浓度的低血清培养基各进行3代次驯化,PK-15细胞能完全适应且生长状态良好;当血清浓度降至10mL/L时,传代1次细胞无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96h各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用该低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种PCV-2后,通过荧光抗体染色测定病毒滴度。结果显示,低血清培养的PCV-2病毒滴度为10~(6.5)TCID_(50)/mL,与常规条件培养的PCV-2对照(病毒滴度为10~(6.375 )TCID_(50)/mL)差别不明显,表明该体系可用于PCV-2的增殖。表明研究建立了PK-15细胞低血清培养PCV-2体系,为PCV-2的相关研究奠定了基础。     

不同水平干乳期对荷斯坦奶牛生长和繁殖性能的影响

试验旨在确定不同干乳期对奶牛泌乳量、乳成分、血液代谢物及卵泡状态的影响。将25初产和多胎次荷斯坦奶牛随机分为2组,干乳期为60 d组13头,干乳期20 d组12头。结果 :将干燥期长度缩短至DP～20对荷斯坦奶牛产奶量、乳成分和繁殖性能有负面影响。20 d较60 d干乳期显著提高了乳蛋白比例(P 0.05),但60 d较20 d干乳期乳蛋白产量显著提高(P 0.05)。与20 d干乳期相比,60 d干乳期奶牛血清非酯化脂肪酸浓度显著提高16%(P 0.05),但干乳期为60 d奶牛血清β～羟丁酸浓度较干乳期为20 d的奶牛显著提高20%(P 0.05)。干乳期为60 d的处理组第一个优势卵泡直径和14 d时第一个优势卵泡直径显著高于干乳期为20 d的处理组(P 0.05)。不同干乳期处理组对奶牛空怀天数、第一次人工授精天数及妊娠配种次数的影响无显著差异(P 0.05)。结论 :将干乳期从60 d缩短至20 d对奶牛泌乳量有负面影响,但牛奶非脂固形物、蛋白质和乳糖含量增加,同时显著降低了血清非酯化脂肪酸、β-羟丁酸浓度及第一个优势卵泡和14 d时第一个优势卵泡直径。     

青海湖裸鲤体外心肌细胞原代与传代培养的研究

为了弥补青海湖裸鲤心肌组织细胞离体培养研究的空白,采用组织块移植培养技术, 分别用DMEM培养基和RPMI 1640培养基对青海湖裸鲤心肌组织进行原代培养.培养48 h可见组织块周围有细胞迁出,并形成生长晕;培养1周可见有单层细胞长成.原代培养的单层细胞用胰蛋白酶-EDTA消化后传代培养至第4代.初步确立青海湖裸鲤心肌细胞培养条件为:培养基RPMI 1640,培养温度27 ℃, pH值7.0～7.5,原代培养血清浓度为20%,传代培养血清浓度为10%,无需通入CO2.     

牛骨髓间充质干细胞体外培养体系的优化

结合红细胞裂解法和全骨髓细胞贴壁培养法分离获得胎牛骨髓MSCs(bBMSCs),经贴壁培养、传代纯化后对其生物学特性进行检测,进而设定不同浓度胎牛血清-血清替代物(FBS-KSR)组合培养基(10%FBS、5%FBS+5%KSR、2.5%FBS+7.5%KSR、10%KSR),对第5代bBMSCs进行体外培养,并对其增殖、多能性及凋亡情况进行检测。结果显示:原代bBMSCs具有贴壁特性,呈成纤维样细胞形态,表达MSCs相关标记分子CD73、CD90、CD105,不表达相关阴性分子标记CD45、CD34;体外具有成脂及成骨分化潜能,生长曲线呈典型的"S"型。CCK8检测显示,5%和7.5%的KSR可作为FBS的替代品,对bBMSCs体外增殖有显著促进作用。荧光定量PCR结果显示:添加不同浓度KSR后增殖相关基因bFGF mRNA水平显著升高(P0.01),进一步证明KSR可以提高bBMSCs的增殖能力;多能性相关基因检测显示,添加KSR组中Oct4、Sox2mRNA表达水平也显著上调;凋亡相关基因检测显示,5%FBS+5%KSR组中抗凋亡基因Bcl2mRNA水平显著上调,而2.5%FBS+7.5%KSR组中Bcl2表达显著下降而促凋亡基因Bax mRNA水平显著提高。推测这是由于细胞传代培养1周时,各组中细胞可能处于生长周期的不同时期,5%FBS+5%KSR和2.5%FBS+7.5%KSR组中细胞已到达平台期,发生生长抑制,需及时传代,而10%FBS组中细胞仍处于对数生长期,未发生细胞凋亡。这也进一步说明,适当浓度KSR缩短了bBMSCs体外增殖周期,提高了细胞的增殖效率。结果表明:培养基中适当添加KSR有利于bBMSCs的体外扩增和多能性维持,同时需注意根据增殖周期变化调整传代时间,这对进一步优化牛及其他动物BMSCs的体外培养条件具有借鉴意义。     

高能微波对体外培养乳鼠心肌细胞生长活力的影响

体外培养的心肌细胞可保持心肌结构及功能上的诸多特点 ,有自发性节律性搏动 ,且不受神经、体液等体内因素的影响 ,因而在实验研究上得到了广泛应用。目前 ,乳鼠心肌细胞的培养方法较多 [1 ] ,但由于心脏细胞成分复杂 ,心肌细胞培养过程较为繁琐 ,应根据实验目的摸索简便快捷的培养方法。随着微波技术的应用 ,微波污染也日益增多 ,并成为日常影响人畜身体健康的主要物理因素之一 [2 ]。本试验对乳鼠心肌细胞的培养方法作了改进 ,并观察了高能微波对乳鼠心肌细胞生长活力的影响。1　材料与方法1 .1　动物　生后 1～ 3d的 Wistar大鼠 (二级 )…     

低含量血清培养IBRS-2细胞及其增殖猪细小病毒N株的研究

依次采用含8%、4%、2%、1%小牛血清MEM培养基驯化IBRS-2细胞,并在驯化好的IBRS-2细胞上接种猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)N株,确定PPV N株在该培养体系下的生长情况。结果显示,用含8%、4%、2%小牛血清MEM培养基各进行5代次驯化,IBRS-2细胞能完全适应且生长状态良好。当血清浓度降至1%时,仅传代1次,细胞就无法保持良好状态,细胞出现贴壁较差、拉网、生长停滞等现象。各血清浓度培养体系中细胞生长曲线测定结果显示,在细胞培养的0、24、48、72、96 h,各组细胞密度与常规培养的对照组差别不明显。因此用MEM培养基培养IBRS-2细胞时,血清最低含量为2%。用该体系培养IBRS-2细胞接种PPV N株后,通过TCID_(50)和HA测定病毒滴度。结果显示,2%血清培养的PPV N株病毒滴度平均值与常规条件培养(6%~10%血清)无明显差别,表明该体系可用于PPV N株的增殖。本研究成功驯化出能在低含量血清培养条件下生长良好的IBRS-2细胞,血清浓度可以降低到2%,且PPV N株在该低含量血清培养的IBRS-2细胞中能良好增殖。     

雏鸡心肌细胞分离及原代培养

为探讨雏鸡心肌细胞的分离、培养方法,采用胶原酶重复多次消化心肌组织,收集每次消化的上清液用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化,离心沉淀细胞后再加入培养基混悬细胞.采用差速贴壁法和化学法纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育,并对培养的心肌细胞进行免疫组化鉴定.结果显示,未贴壁时心肌细胞呈圆形,培养12～24 h心肌细胞开始贴壁生长,细胞伸出伪足呈梭形、多角形,3～4 d后形成细胞簇,5～7 d后细胞汇合成片.免疫组化结果表明α-SA抗原表达阳性,证明培养的细胞为心肌细胞,应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的雏鸡心肌细胞.     

不同培养条件对水貂毛囊体外培养的影响

旨在筛选较理想的水貂毛囊体外培养条件,建立水貂毛囊体外培养模型,从而为研究水貂毛囊生物学特性和生长调控机制奠定基础。在无菌条件下分离水貂初级毛囊,分别置于Williams E无血清培养基、Williams E血清+10%血清、DMEM无血清和DMEM血清+10%血清4种不同培养基中进行培养,观察毛囊最终长度及形态学变化,选出水貂毛囊体外培养的最适培养基;再将最适培养基中的毛囊置于6个不同的培养温度下进行培养,即29℃、31℃、33℃、35℃、37℃和39℃,选出最适温度。结果发现体外培养的水貂毛囊在Williams E无血清培养基中毛囊的最终生长长度显著高于其他处理组(P0.05),水貂毛囊生长速度随培养时间的增加显著减慢(P0.05);在31℃培养的毛囊生长速度显著高于其他组(P0.05),且毛囊形态较好。研究结果表明,水貂毛囊体外培养的适宜培养基为Williams E无血清培养基,适宜培养温度为31℃。     

昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素

为了研究影响胚胎干细胞(ESC)体外分离克隆的因素,试验采用3~5日龄大鼠心肌细胞制成心肌细胞条件培养基(RH-CM),比较了4种培养体系对小鼠胚胎干细胞体外培养的影响,并分析比较了不同饲养层对胚胎干细胞分离克隆造成的影响。结果表明:添加重组鼠白血病抑制因子和心肌细胞条件培养基在胚胎贴壁率、内细胞团(ICM)形成率和原代胚胎干细胞集落形成率以及抑制分化的过程中起到的作用显著优于未添加任何诱导成分的培养基;作为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离培养胚胎干细胞的效果优于小鼠睾丸支持细胞(MS)。     

鸡小黄卵泡颗粒细胞的培养条件优化

为了研究禽类颗粒细胞的功能,建立一套良好的颗粒细胞培养体系至关重要。该研究分离培养了产蛋高峰期母鸡的6～8 mm小黄卵泡颗粒细胞,在细胞基质、不同物种血清、血清浓度上进行优化。结果表明,鼠尾胶原比明胶预铺更能促进颗粒细胞生长,细胞传代至4代才发生死亡。2.5%鸡血清与2.5%FBS(fetal calf serum)、2.5%鸡血清+2.5%FBS相比,2.5%鸡血清传代后细胞形态优于其他组。显微镜观察和EdU(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)检测表明,随着鸡血清浓度的增加,颗粒细胞增殖增加。该研究建立了在预铺鼠尾胶原作为胞外基质,采用含5%鸡血清的培养体系,使得鸡小黄卵泡颗粒细胞传代后仍能保证其增殖特性。     

双氢睾酮诱导大鼠心肌细胞肥大模型的建立

应用胰蛋白酶分次消化法分离乳鼠心肌细胞,以差速贴壁法纯化心肌细胞,α-sarconme-actin抗体免疫细胞化学染色鉴定心肌细胞。心肌细胞在无血清无酚红培养基中培养48h后,用双氢睾酮(DHT)诱导心肌细胞肥大,建立心肌细胞肥大模型。24h后检测心肌细胞肥大的指标心肌细胞表面积;BCA法测定心肌细胞蛋白含量;半定量RTPCR两步法检测心肌细胞肥大的特征性基因—心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF,β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)mRNA的表达。结果显示免疫细胞化学染色显示培养的心肌细胞纯度达到90%以上,心肌细胞分离良好。与对照组相比,10-8 mol/L的DHT能显著的增加心肌细胞表面积、蛋白质含量、ANP和β-MHC基因表达的增加(P0.01),心肌细胞肥大模型建立成功。