獐茅AIHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因,根据已克隆的AIHAK1及β-actin碱基序列,分别设计了实时定量特异性引物,优化了反应的退火温度与引物浓度,并以优化的条件建立了相对定量标准曲线,同时对该方法的稳定性进行了评价.结果表明AIHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1.09和1.04,线性相关系数分别为0.996和0.997,批内及批间变异系数<5%.所建立的A1HAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好,为进一步探索AIHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AIHAK1农作物的检测奠定了方法学基础.     

獐茅AlHAK1 Real-time PCR定量方法的建立

以β-actin为内参基因，根据已克隆的AlHAK1即β-actin碱基序列，分别设计了实时定量特异性引物，优化了反应的退火温度与引物浓度，并以优化的条件建立了相对定量标准曲线，同时对该方法的稳定性进行了评价。结果表明AlHAK1及β-actin基因的real-time PCR扩增效率分别为1．09和1．04，线性相关系数分别为0．996和0．997，批内及批间变异系数〈5％。所建立的AlHAK1 real-time PCR定量方法操作简便、定量准确、重复性好，为进一步探索AlHAK1的功能、mRNA表达水平的变化及转AlHAK1农作物的检测奠定了方法学基础。     

苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

盐胁迫下盐穗木miR393b与预测靶基因HcTIR1的表达及相关性

【目的】研究盐胁迫下盐穗木生长素通路中miR393b和预测的靶基因TIR1的表达模式和相关性。【方法】采用生物信息学方法预测盐穗木miR393b的靶基因;通过qRT-PCR方法检测盐胁迫下盐穗木miR393b及预测靶基因HcTIR1(transport inhibitor response1)的相对表达模式,并分析其相关性。【结果】miR393b成熟体在不同植物种中高度保守;盐穗木miR393b预测的靶基因为TIR1;盐胁迫处理,盐穗木同化枝中两基因响应高盐胁迫,并具有一定的负相关性。【结论】盐穗木miR393b和预测的靶基因响应高盐胁迫,二者具有一定的负相关。该结果为进一步探讨盐穗木miR393b与预测靶基因TIR1的生物学功能奠定基础。     

杏鲍菇采后木质化相关基因实时定量PCR中内参基因的选择

【目的】筛选出合适的内参基因,为分析不同贮藏时期杏鲍菇(Pleurotus eryngii)子实体中木质化相关基因的表达提供支持。【方法】以4℃低温贮藏0,3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体为材料,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)技术,分析了β-actin、18SrRNA、β-tubulin、ELF和GAPDH 5个候选内参基因在不同贮藏时期杏鲍菇的表达情况;通过GeNorm和NormFinder 2种软件筛选出最稳定的内参基因;选取最佳内参基因,采用相对表达定量法对木质素合成途径中的关键酶,即苯丙氨酸转氨酶(Phenylalanina ammonia-lyse,PAL)基因的表达进行定量分析。【结果】5个内参基因均能特异扩增,其中GAPDH基因表达丰度较低,不适合用作内参基因;经GeNorm软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA表达稳定度平均值M分别为0.527,0.527,0.584,0.875,最适内参基因组合为β-actin、β-tubulin和ELF;由NormFinder软件分析计算,β-actin、β-tubulin、ELF、18SrRNA稳定值S分别为0.221,0.356,0.583,1.092,β-actin稳定性最高;综合分析认为β-actin的表达稳定性最高,为最佳内参基因;以β-actin为内参基因,发现4℃低温贮藏3,6,9,12,15和18d的杏鲍菇子实体中PAL基因表达量分别比新鲜样品(0d)增加了11.3%,10.8%,11.3%,11.5%,11.4%,10.7%。【结论】β-actin可作为杏鲍菇子实体采后贮藏条件下品质变化相关基因表达研究的内参基因。     

奶牛GPR109A基因SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立奶牛G蛋白偶联受体109A基因(GPR109A)的实时荧光定量PCR检测方法,为开展奶牛产后脂类代谢紊乱及酮病发生机理研究奠定基础。【方法】根据Gen Bank中奶牛GPR109A基因和β-actin基因(内参基因)的m RNA保守序列设计合成两对引物,以奶牛肝脏组织c DNA为模板,PCR扩增目的基因后与载体连接构建重组质粒,以SYBR Green I实时荧光定量PCR进行扩增,绘制标准曲线,并对其特异性、敏感性、重复性等进行检验。【结果】GPR109A基因和β-actin基因的实时荧光定量PCR标准曲线方程分别为y=-3.309x+10.92(R2=0.9985)和y=-3.289x+9.794(R2=0.9997),扩增效率分别为101.0%和100.0%。特异性试验结果显示,GPR109A基因和β-actin基因的溶解曲线峰单一,无引物二聚体和非特异性扩增产物生成;敏感性试验结果显示,线性扩增范围广,可检测到1.8×102个拷贝的GPR109A基因;重复性试验结果显示,各扩增反应的变异系数(CV)小于或等于1.7%。【结论】基于GPR109A基因建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR具有操作简便、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可用于牛源性GPR109A基因表达量的快速检测和定量分析。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR方法的建立

【目的】利用SYBR GreenⅠ荧光定量技术建立一种相对定量检测坦布苏病毒的方法。【方法】针对坦布苏病毒NS5、E基因分别设计了1对特异性引物,同时设计1对扩增内参基因β-actin引物,将PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释作为质控样品,用于实时荧光定量PCR中NS5、E基因及内参基因β-actin标准曲线的构建,并进行反应的灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】结果显示标准曲线线性关系R2值均在0.99 以上, 检测极限约为1.0E+01拷贝数质粒DNA;特异性结果表明只能检测到坦布苏病毒的扩增曲线;批内和批间重复性试验的变异系数均小于0.5%;用已建立的方法对临床样品进行3次重复检测,病毒RNA的检出率为100%。【结论】本研究初步建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法,为养鸭场诊断和监测坦布苏病毒提供了一种新的特异、灵敏的检测方法。     

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

麦洼牦牛TLR1基因组织表达分析

【目的】建立一种牦牛TLR1基因表达量的荧光定量PCR检测方法,并分析TLR1基因在牦牛不同组织中的表达差异。【方法】参考牦牛TLR1基因序列,在其保守区设计特异性引物,并以牦牛β-actin基因为内参基因建立荧光定量方法;基于该荧光定量方法分析TLR1基因在牦牛心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、乳腺、肌肉、卵巢11种组织中的表达水平。【结果】TLR1基因和β-actin基因扩增产物电泳结果呈现单一条带,其产物熔解曲线均为特异的单峰,表明引物具有较高的特异性。组织表达结果显示,TLR1基因在所检测的牦牛11个组织样本中均有表达,其中在肾、肝、脾、肺、卵巢、小肠中表达量较高,在胃、乳腺、心、大肠、肌肉组织中表达量较低。【结论】TLR1基因在牦牛各组织中转录水平差异较大,这可能与各组织对病原体的识别和抵抗能力有关。     

仿刺参β-actin基因的克隆及在各组织中的表达

参考海葵Nematoste Uavectensis在GenBank中的β-actin基因mRNA部分序列（XM_001630533）设计引物,对仿刺参Apostichopusjaponicus进行特异的PCR扩增,将扩增产物测序分析,再根据测序结果设计仿刺参专用β-actin引物ACT1／ACT2,对不同退火温度和循环次数条件下的该基因RT-PCR产物进行了对比。本研究中首次克隆了仿刺参的β-actin基因,为今后仿刺参目的基因表达的半定量分析研究奠定了基础。     

大蒜内参基因筛选及AsACO基因对盐胁迫和促生菌的响应分析

【目的】筛选大蒜在盐胁迫下的稳定内参基因,并分析1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（AsACO）对盐胁迫和促生菌的响应表达特性,为深入探究促生菌的促生机制及大蒜对盐胁迫的响应机制研究提供理论参考。【方法】以乐都紫皮大蒜为试材,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测5个内参基因ACT、UBC、HIS3、18S rRNA、TUB在盐胁迫下的表达稳定性,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper筛选出最稳定的内参基因,并分析恶臭假单胞菌UW4对盐胁迫下AsACO基因表达的影响。【结果】 5个候选内参基因引物的特异性强、无引物二聚体。GeNorm分析得出候选内参基因稳定性排名为18S rRNA=TUB>HIS3>UBC>ACT,NormFinder分析得出内参基因稳定性排名为18S rRNA>HIS3>TUB>UBC>ACT,BestKeeper分析得出内参基因稳定性排名为UBC>HIS3>18S rRNA>TUB>ACT,最终以几何平均数综合分析得出18S rRNA为最稳定的内参基因。以18S rRNA为内参基因,检测出AsACO基因表达具有明显的组织特异性,在叶片中的相对表达量明显高于根。整个处理过程中,盐胁迫明显诱导AsACO基因在不同处理时间及不同组织中表达上调,根和叶片中AsACO基因的相对表达量分别在2 d和12 h时达最高,较正常培养（CK）分别显著升高124.43%和238.34%（P<0.05,下同）,与盐胁迫处理相比,盐胁迫+浇施恶臭假单胞菌UW4处理显著降低AsACO基因在不同处理时间根和叶片中的相对表达量,其中在2 d和12 h时降幅较大,分别降低了112.08%和343.34%。【结论】18S rRNA是盐胁迫下大蒜中最稳定的内参基因。盐胁迫可诱导大蒜根和叶片中AsACO基因的上调表达,从而间接促进ACO和乙烯水平升高,加速由乙烯调控的细胞衰老,甚至死亡,但盐胁迫下恶臭假单胞UW4具有抑制AsACO基因表达的作用,以减少ACO和乙烯的合成,从而延缓大蒜细胞衰老,提高逆境耐受性。     

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择

【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan Drop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)的特异性引物序列,逆转录得到cDNA模板后,按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测,采用Ge Norm法对定量结果进行综合分析,最后根据内参基因稳定性值(M值)的大小筛选出最稳定的参考基因;M值越小,表明内参基因的稳定性越好,反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现,均无非特异扩增及引物二聚体,说明各内参基因特异性良好,qRT-PCR反应的专一性高;以Ct值为纵坐标,相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知,各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系;通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现,蛋白编码基因中,最稳定的为TBP,最不稳定的是GAPDH;miRNA候选内参中,最稳定的为U6,最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因TBP和U6,可作为猪睾丸组织基因表达研究中最佳内参基因候选者。     

盐胁迫下盐穗木DNA甲基化程度与去甲基化酶基因(Ros1)表达的相关性研究

【目的】甲基化和去甲基化协同调控的DNA甲基化直接影响逆境胁迫相关基因的表达,植物的DNA去甲基化主要由去甲基化酶基因Ros1(Repressor of Silencing 1)介导的碱基切除修复实现。开展盐穗木(Halostachys caspica)DNA甲基化程度与HcRos1表达动态变化的分析,有助于阐明DNA甲基化应答盐胁迫的分子机制。【方法】利用qRT-PCR测定盐胁迫下盐穗木幼苗同化枝和根基因组DNA的甲基化程度,探讨DNA的甲基化程度与去甲基化酶基因HcRos1表达的相关性。【结果】在相同NaCl浓度胁迫不同时间下盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度呈现先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的DNA甲基化程度大多高于根中的基因组甲基化程度,且均在24 h达到最高DNA甲基化程度。而在不同浓度NaCl胁迫处理24 h时,盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度也是先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的基因组甲基化程度高于根中的基因组甲基化程度,且多在100 mmol/L达到最高DNA甲基化程度。HcRos1的基因表达量在低浓度NaCl胁迫下变化不大,但在700 mmol/L NaCl胁迫72 h时则显著升高。【结论】HcRos1表达量与DNA甲基化水平呈明显的负相关,盐胁迫能够提高HcRos1的表达,降低基因组DNA的甲基化程度,增强植物的耐盐性。     

绵羊朊病毒受体37kD/67kD LRP/LR实时荧光定量PCR标准质粒和标准曲线的构建

为实时相对荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体LRP/LRmRNA表达水平,构建目的基因LRP/LR、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线;根据GeneBank中绵羊37 kD/67 kDLRP/LR(LRP/LR)和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物;提取肠道组织mRNA,经反转录RT-PCR扩增,产物回收纯化后,与pGEM-T-easy载体连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;质粒提取后经酶切、PCR和测序鉴定后,获得阳性LRP/LR,β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107~102梯度稀释作为模板,然后进行实时荧光定量PCR;系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果显示产物溶解曲线峰值单一,说明无引物二聚体及引物特异性高;LRP/LR和-βactin标准曲线相关系数分别为r2=0.999,r2=0.997,说明线性关系好;重复性试验结果显示所构建的重组质粒10次同条件扩增均Ct值具有较好的重现性,且变异率均小于5%,说明标准曲线重复性好,稳定性高。说明成功构建目的基因LRP/LR,内参基因β-actin标准质粒和标准曲线,为实时荧光定量PCR检测绵羊组织中朊病毒受体mRNA表达水...     

盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8在盐胁迫下的表达与相关性分析

【目的】盐穗木(Halostachys caspica)是一种藜科多年生盐生灌木,对盐分适应性极强。miR167是作用于生长素信号通路上的内源非编码小RNA分子,它通过靶向生长素响应因子ARFs(auxin response factors)来调控生长素响应基因的表达。研究从高盐(600 mmol/L NaCl)处理48 h盐穗木根的小RNA文库中筛选到差异表达的miR167d,并从该物种的转录组数据中预测到其靶基因ARF8。该文开展了高盐胁迫下盐穗木miR167d和预测靶基因ARF8的表达模式和相关性分析。【方法】通过荧光定量PCR试验检测和分析高盐胁迫下盐穗木miR167d和预测靶基因的表达模式和相关性;利用烟草瞬时表达试验间接地鉴定盐穗木miR167d对预测靶基因ARF8的靶向关系;采用同源克隆方法结合RACE技术获得盐穗木miR167d的靶基因ARF8的全长序列,并进行生物信息学分析。【结果】(1) 600 mmol/L NaCl处理盐穗木,其同化枝中miR167d和ARF8的表达均受到诱导,胁迫48 h时,miR167d的表达最高并与靶基因的表达呈现显著的负相关性,HcARF8基因的表达随胁迫处理时间的延长呈现先增加后下降的趋势,推测盐穗木miR167d和ARF8两基因可能在响应盐胁迫过程中发挥作用。(2) 构建融合GFP的含预测靶基因HcARF8的植物表达载体并转化农杆菌,烟草瞬时表达试验的结果表明,拟南芥miR167d对盐穗木ARF8基因具有剪切作用,间接证明盐穗木miR167d对预测的靶基因HcARF8具有靶向切割作用。(3) 克隆获得的盐穗木ARF8基因全长2 861 bp,ORF 2 442 bp,编码813个氨基酸,在编码区与盐穗木miR167d高度互补匹配。生物信息学分析该基因编码的蛋白高度保守,与同科植物甜菜ARF8同源性达到87%,都具有能与生长素相关元件(B3 DNA绑定元件、生长素响应元件,生长素诱导转录IAA超家族的元件)结合的功能域。【结论】盐穗木miR167d和HcARF8基因具有靶向关系,高盐胁迫处理盐穗木,其同化枝中两基因的表达都受到诱导并呈现显著的负相关性。这些结果为后续阐明盐穗木miR167d与其作用的靶基因ARF8的生物学功能奠定基础。     

盐穗木对盐渍荒漠区不同土壤水盐含量的适应机制研究

【目的】研究不同土壤盐分和水分含量条件下,盐渍生境中盐穗木(Halostachys caspica)体内水分、无机离子和有机渗透调节物质含量的变化特征。【方法】按土壤盐含量(土壤电导率)的不同,在新疆阜康荒漠生态站附近盐渍化荒漠区设置了样地1(土壤电导率为3.56mS/cm,土壤含水率为3.39%)、样地2(土壤电导率为7.39mS/cm,土壤含水率为11.34%)和样地3(土壤电导率为7.71mS/cm,土壤含水率为6.49%),对不同样地的土壤(0~60cm土层)及所生长的盐穗木进行采集,分析土壤的基本理化性质,同时测定植物样品中的含水率、无机盐离子及有机渗透调节物质含量等指标。【结果】3个样地中,土壤Na+、Cl-含量均较高,K+、Ca2+、Mg2+含量均较低,土壤均呈碱性,有机质含量较低。在同一样地中,盐穗木根、茎、叶中的Na+、Cl-含量较高,且均表现为叶茎根。而在同一部位,不同采样点Na+、Cl-含量总体表现为样地3样地2样地1。盐穗木地上和地下部分含水率与3个样地土壤含水率变化一致,即样地2显著高于样地3和样地1。样地3盐穗木地上和地下部分肉质化程度均最高,显著高于样地1和样地2。样地1和样地2盐穗木叶片可溶性糖含量显著高于样地3,脯氨酸含量的变化则与可溶性糖含量相反。【结论】在盐渍生境中,盐穗木受到水分与盐分的双重胁迫时会抑制其对盐分的吸收。盐穗木进行渗透调节时,在盐含量较低及水分含量充足的土壤中以合成可溶性糖为主,而随着盐胁迫的增加,土壤中盐含量较高且水分含量较低时,则以合成脯氨酸为主。在不同土壤盐含量和水分含量条件下,盐穗木抵抗盐胁迫的机制有明显差异。     

温度对荒漠昆虫小胸鳖甲幼虫肌动蛋白基因表达的影响

[目的]肌动蛋白β-actin是应用实时荧光定量PCR检测基因表达的常用内参基因,测定和分析荒漠昆虫小胸鳖甲幼虫中β-act in基因表达的稳定性,判断其是否可作为内参基因.[方法]选取不同龄期的小胸鳖甲幼虫经过42、5、10和15℃处理不同时间后,利用实时荧光定量PCR检测β-act in基因的表达,以基因绝对拷贝数的对数进行单因素方差分析.[结果]小胸鳖甲幼虫在不同龄期β-actin的表达有显著差异;1龄幼虫在不同温度处理后,β-actin的表达都有显著升高;4龄幼虫在不同温度处理后β-actin的表达基本上没有变化;7龄幼虫在10、15和42℃条件下β-actin的表达都显著升高,但5℃处理没有影响.[结论]小胸鳖甲幼虫的β-actin基因具有发育阶段性差异性表达特点,温度对不同龄期幼虫的β-actin基因表达的影响不同,β-actin基因可能不适合在小胸鳖甲幼虫基因表达分析中作为内参基因.     

中国南瓜内参基因18S rRNA的克隆及其引物开发

【目的】克隆获得中国南瓜18SrRNA,并设计合适的荧光定量PCR内参,为开展中国南瓜重要功能基因的表达模式和调控机制研究奠定基础。【方法】以中国南瓜‘密本’品种的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆中国南瓜18SrRNA基因序列,再利用Primer Premier软件设计荧光定量PCR引物,对该内参基因在中国南瓜不同组织、生长阶段及非生物胁迫条件下的表达稳定性进行检测。【结果】首次克隆得到中国南瓜18SrRNA基因序列,其长度为1 857bp,GenBank登录号为KM979454,该基因与西瓜、西葫芦等瓜类蔬菜18SrRNA基因同源性大都在90%以上;以中国南瓜内参基因18SrRNA核苷酸全长序列为基础设计1对荧光定量PCR引物,以中国南瓜果肉总RNA逆转录的cDNA第一链为模板进行PCR扩增,该引物扩增的片段大小为132bp,扩增效率高,特异性强;18SrRNA基因在中国南瓜不同组织、生长发育阶段及非生物胁迫条件下均能稳定表达。【结论】克隆获得中国南瓜18SrRNA基因,该基因适合在中国南瓜基因表达研究中作为内参基因。     

β-actin基因在荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲中表达的稳定性研究

为检测生活习性截然相反的两种荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲的β-actin基因在不同温度下的表达是否稳定,对不同温度处理和不同季节采集的昆虫提取总RNA反转录合成cDNA后,进行荧光实时定量PCR检测。以Ct值作为β-actin基因表达水平的测定值。通过方差分析显示:光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节无显著差异,而小胸鳖甲则表现出β-actin基因表达的季节性差异;在不同温度处理条件下,光滑鳖甲β-actin基因表达比小胸鳖甲的要稳定。研究认为β-actin可作为研究光滑鳖甲不同温度下基因表达的内参基因,而β-actin则不适合用做研究小胸鳖甲在不同温度下基因表达的内参基因。     

米蛾β-actin基因cDNA片段的克隆及表达量检测

为克隆米蛾[Corcyra cephalonica(Stainton)]β-actin基因cDNA片段,建立米蛾β-actin基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,并评估其在实时荧光定量研究中作为内参基因的可靠性,利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆获得米蛾β-actin基因cDNA片段,采用SYBR GreenⅠ染料法建立qRT-PCR方法,检测在米蛾卵、幼虫、蛹和成虫4个虫态中β-actin基因的表达量。获得了长为822bp的米蛾β-actin基因片段(Gen Bank accession:KJ599569),编码273个氨基酸残基;荧光定量标准曲线的Ct值检测范围为13~28,扩增效率为90.1%,相关系数R~2=0.992,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为(84±0.5)℃,符合定量要求;实时荧光定量结果表明,β-actin基因在米蛾不同发育历期中的表达水平无显著性差异(p0.05)。成功建立了米蛾β-actin基因qRT-PCR方法 ,β-actin基因可以作为米蛾基因表达定量研究中的可靠内参基因。研究结果为β-actin作内参基因进行米蛾功能基因表达差异研究奠定了分子基础。