猪脑心肌炎病毒非结构蛋白3AB基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

利用PCR方法扩增获得EMCV非结构蛋白3AB基因,并将其克隆至杆状病毒转座载体pFastBacTM中,提取阳性克隆质粒转化至DH10Bac感受态细菌,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到重组杆状病毒穿梭载体Bacm id-3AB,经脂质体介导转染sf9细胞获得重组杆状病毒,并IFA和W estern b lotting鉴定其抗原性。结果表明,EMCV 3AB基因在昆虫细胞中获得成功表达,分子量约16 ku,具有良好的EMCV抗原性。因此利用杆状病毒表达系统成功表达了EMCV 3AB基因,为该病毒抗原表位和诊断方法研究奠定了重要基础。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

利用杆状病毒Bac-to-Bac系统在家蚕表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的E蛋白和M蛋白

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害养猪业的传染性病原。PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白基因是开发PRRSV病毒新型疫苗的目标基因。利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统,将PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白的基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb中,获得重组转移质粒pFastBacHTb-E和pFastBacHTb-M,转化大肠杆菌Bm DH10 Bac感受态细胞,获得重组杆粒BmNPV Bacmid-E、BmNPV Bacmid-M,将这些重组杆粒转染家蚕培养细胞Bm5,获得重组病毒BmNPV-E和BmNPV-M。将2种重组病毒分别接种5龄起蚕,用SDS-PAGE和Western blotting方法在重组Bacmid DNA转染的Bm5细胞和感染重组病毒的家蚕幼虫血细胞中分别检测到分子质量约20 kD和18 kD的E蛋白和M蛋白,表明PRRSV病毒的E蛋白和M蛋白在家蚕培养细胞及幼虫体内获得了表达,为利用家蚕-杆状病毒表达系统研制PRRSV的新型疫苗与诊断试剂奠定了基础。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。     

猪瘟病毒cF114株E2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达

为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。     

家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。     

家蚕G蛋白诅亚基（BmGγ1）的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子，参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制，运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基（Gγ1）的序列，设计引物验证预测序列后，克隆了家蚕Gγ1的序列，再通过酶切克隆至表达载体pET-41b（＋）后，导入E．coli BL21宿主菌中，经异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶（glutathione s-transferase，GST）融合蛋白，并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白，说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因，并在E．coli BL21中高效表达。     

利用杆状病毒系统在昆虫细胞TN5中表达家蚕30K蛋白

为研究30K蛋白抑制细胞凋亡的作用,利用RT-PCR从家蚕总RNA中扩增到30KC19基因,对其进行了序列分析并克隆到杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,构建成重组转座载体pFastBacHTb-30KC19。利用杆状病毒(Bac-to-Bac)表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞TN5中进行了表达和蛋白检测。结果表明30K蛋白在昆虫细胞中得到了高效表达。     

鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

将含有鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因的重组转座载体PFF转染昆虫细胞sf9,28℃培养,待细胞出现明显病变后,收取细胞,反复冻融,接种sf9昆虫细胞,如此再传代1次,收集细胞保留毒种,同时做表达产物的检测,结果表明,表达产物约占细胞总蛋白的10%,并有良好的反应原性。     

对虾白斑综合症病毒VP28基因在家蚕体内的表达

VP2 8是对虾白斑综合症病毒 (Whitespotsyndromevirus,简称WSSV)的囊膜蛋白。在克隆了VP2 8基因的基础上 ,成功构建了重组转移载体pBlueBacHisC vp2 8和重组杆状病毒HyNPV VP2 8。用重组病毒的细胞培养液注射接种 5龄饷食后的家蚕 ,剪病蚕腹足采血淋巴 ,进行SDS PAGE和Westernblotting分析 ,结果表明 ,WSSV VP2 8基因在家蚕体内得到了表达 ,特异性条带大小约为 31kD。研究结果为探讨WSSV感染对虾的分子机制打下了基础。     

鲤鱼春季病毒出血症病毒G基因在昆虫细胞中的表达与鉴定

采用RT-PCR方法扩增鲤鱼春季病毒出血症病毒（SVCV）的糖蛋白（G）基因,将PCR产物插入到杆状病毒转移载体pFastBac 1中,获得重组转移载体pFastBac 1-G,将其转化入含有Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,经3种抗性和蓝白斑筛选,获得含有G基因的重组穿梭质粒rBacmid-G。在脂质体转染试剂的介导下,将rBacmid-G转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。提取重组杆状病毒基因组,用M13引物PCR鉴定。对重组杆状病毒感染的sf9细胞,通过电镜观察、SDS-PAGE、Western blotting进行检测,结果表明,重组蛋白在sf9细胞中获得正确表达,相对分子质量约58 000,与鼠抗SVCV阳性血清具有良好的反应原性。本试验为研究鲤鱼春季病毒出血症病毒G蛋白的生物学活性和亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

利用非转座子载体介导的转基因家蚕表达人胰岛素样生长因子Ⅰ

为了实现利用非转座子载体介导的转基因家蚕整体表达人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ),将hIGF-Ⅰ基因克隆进非转座子类型的昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建转基因载体pIZT/V5-His-hIGF-Ⅰ。利用精子介导法将该转基因载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR和Dot blotting检测鉴定,表明已成功获得hIGF-Ⅰ转基因家蚕。对培育至G2代的转基因家蚕5龄幼虫蛋白质样品进行Western blotting分析,结果显示hIGF-Ⅰ在转基因家蚕中获得表达,重组hIGF-Ⅰ的分子质量约12.5 kD;ELISA检测hIGF-Ⅰ在G2代转基因家蚕5龄幼虫全蚕以及后部丝腺、脂肪体冻干粉中的质量比分别为65、411、469 ng/g。试验结果再次证实通过非转座子载体pIZT/V5-His介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因在转基因家蚕中整体表达。     

PEDV分离株S1基因的重组杆状病毒真核表达

为了研究猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)分离株(PEDV/LA/2014/02)纤突蛋白(S1)的真核表达及其反应原性,本研究利用杆状病毒真核表达系统表达出重组His-PEDV-S1蛋白。利用在线软件分析PEDV S1基因在sf9细胞内的稀有密码子,经优化密码子后的基因进行人工合成,合成后的PEDV S1基因被克隆至杆状病毒的穿梭载体(pFastBac HT A)中,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行重组,PCR方法验证后将重组成功的杆状病毒基因组转染sf9细胞,获得包装成功的杆状病毒,该病毒进一步接种sf9细胞,显微镜观察重组病毒引起的细胞病变,RT-PCR方法验证PEDV S1基因的mRNA表达水平,SDS-PAGE、Western blotting方法验证重组PEDV S1蛋白的表达及其反应原性。结果显示,试验成功构建了重组穿梭质粒pFastBac HT A-PEDV-S1(pSL598),成功包装表达了PEDV S1的重组杆状病毒,重组杆状病毒能使sf9细胞出现细胞变大、胞内有空泡等典型病变,PEDV S1基因的mRNA获得表达,重组蛋白His-PEDV-S1在sf9细胞中得到表达,蛋白质大小为83 ku左右,主要存在于细胞沉淀中,表达的重组蛋白能与小鼠抗His抗体和猪抗PEDV阳性血清反应,说明该蛋白具有较好的反应原性。本研究为研制PEDV新流行毒株新型亚单位疫苗和防控该毒株的流行提供了材料。     

新孢子虫NcSRS2基因的亚克隆和表达

本研究根据NcSRS2基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入EcoRI,XhoI酶切位点,用PCR技术从pGEX-NcSRS2重组质粒扩增截去N端疏水氨基酸序列NcSRS2的基因片段（以下称dNcSRS2）,插入到pGEX-6p-1质粒的多克隆位点,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,于氨苄阳性LB培养平板上筛选阳性克隆,酶切及PCR鉴定;经IPTG诱导在E.coli中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并纯化.结果表明,新孢子虫dNcSRS2基因体外扩增产物与预期值相符,约1041bp;所构建pGEX-dNcSRS2重组质粒经双酶切与PCR鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE和免疫印迹显示,表达融合蛋白的分子量约为62.6 kD,表达效率为32.3%,该蛋白具有特异的免疫反应性,为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和疫苗的研制奠定了基础.