NEFA BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响

为了验证奶牛酮病发病过程中机体会产生大量的NEFA(非酯化脂肪酸)、BHBA(β-羟丁酸)可能是脂类代谢关键的调节因素。本试验通过对培养的牛肝细胞添加NEFA和BHBA研究NEFA以及BHBA对牛肝细胞的结合珠蛋白(hap-toglobin,HP)和血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A protein,SAA) mRNA表达的影响。根据荧光定量PCR法测定NEFA、BHBA对体外培养牛肝细胞的HP和SAA mRNA表达的影响,以及NEFA、BHBA等代谢产物对急性期反应蛋白HP、SAA表达影响的结果,得出结论,中等浓度的NEFA对于体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有促进作用,高浓度的NEFA对HP、SAA基因的表达影响较小;中等浓度的BHBA体外新生犊牛肝细胞中的HP、SAA基因的表达具有一定的抑制作用,中高浓度抑制作用不明显,对于SAA基因,只有BHBA在1. 2 mmol/L浓度下抑制作用明显,高浓度的BHBA对HP、SAA基因的表达影响很小。     

NEFA和BHBA对体外培养的脂肪细胞HSL、ADPN mRNA表达的影响

在体外培养的牛脂肪组织和脂肪细胞中,分别添加5个浓度梯度的NEFA和BHBA,均设3个重复,通过荧光定量PCR技术,观测不同浓度的NEFA和BHBA对牛脂肪细胞ADPN mRNA与HSL mRNA丰度的影响。结果表明:NEFA在一定浓度范围内(0.2~0.8 nmol/L)对ADPN mRNA表达有显著促进作用并呈剂量依赖性,而高浓度(>1.6 nmol/L)时又显著下调其表达;0.2~0.8 nmol/L NEFA对HSL mRNA的表达有抑制作用,呈剂量依赖性,但在高浓度时(>0.8 nmol/L)反而促进了其表达(P<0.05)。低浓度的BHBA对HSL mRNA的表达无显著抑制作用,高浓度(1.2 mmol/L)的BHBA显著下调HSL mRNA的表达,并呈剂量依赖性;低浓度(<0.6mmol/L)的BHBA对ADPN mRNA的表达无明显作用,但高浓度的BHBA(>0.6 mmol/L)对ADPN mRNA的表达具有明显的抑制作用(P<0.05)。结论:代谢中间产物可通过促进ADPN mRNA或抑制HSL mRNA的表达来调节脂肪代谢。     

游离脂肪酸对原代培养奶牛肝细胞脂代谢的影响

本实验旨在探讨游离脂肪酸(Nonestesterified fatty acids,NEFA)对体外培养奶牛原代肝细胞脂代谢的影响。选择培养48 h的奶牛原代肝细胞,添加不同浓度的NEFA(0、0.6、1.2、2.4 mmol/L)继续培养12 h,每个浓度5个重复。运用免疫印迹western blot方法,检测NEFA对奶牛原代肝细胞脂代谢信号通路关键蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)和固醇调节元件结合蛋白-1c(Sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)蛋白表达水平的影响。利用甘油三酯检测试剂盒检测NEFA对奶牛原代肝细胞内甘油三酯含量的影响。结果显示,与对照组相比,0.6、1.2和2.4 mmol/L NEFA组PPARα蛋白表达水平显著降低(p0.01),而SREBP-1c的蛋白表达水平在NEFA浓度为1.2和2.4 mmol/L时显著降低(p0.01),同时,细胞内甘油三酯的含量在NEFA浓度为0.6 mmol/L时即显著升高(p0.01),且呈浓度依赖性。结果表明,高浓度的NEFA可以损伤体外培养奶牛原代肝细胞脂代谢信号通路,增加肝细胞内甘油三酯的沉积。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸（NEFA）、β-羟丁酸（BHBA）和葡萄糖（GLU）在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用，应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体（GLNR）mRNA丰度的影响。结果，随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高，GLNRmRNA的表达量逐渐增加（P〈0．01）。表明，代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

上海地区奶牛产后低钙血症及酮病发病率调查

本研究对上海地区9个牧场奶牛产后低钙血症和酮病的发病率进行了调查,结果表明:奶牛产后12 h内的低钙血症发病率平均为86.1%,血钙平均浓度为(1.82±0.02)mmol/L,产后3~7 d低钙血症发病率平均为35.2%,血钙平均浓度为(2.05±0.01)mmol/L,表明随着泌乳天数的增加,低钙血症有缓解趋势。奶牛产后12 h内酮病发病率平均为5.5%,血液β-羟丁酸(BHBA)平均浓度为(0.68±0.04)mmol/L,产后3~7 d酮病发病率平均为16.3%,血液BHBA平均浓度为(0.98±0.07)mmol/L,表明随着泌乳天数增加能量负平衡有加重趋势。奶牛产后12 h内高游离脂肪酸(NEFA)发生率平均为49.4%,血液NEFA平均浓度为(0.76±0.03)Meq/L,产后3~7 d高NEFA发生率平均为41.3%,血液NEFA平均浓度为(0.71±0.03)Meq/L,表明泌乳初期高NEFA发生率远高于酮病发病率,随着泌乳天数增加血液NEFA浓度有下降趋势。奶牛产后血液中钙的浓度与NEFA浓度呈极显著负相关(P0.01),血液中NEFA浓度与BHBA浓度呈极显著正相关(P0.01)。     

奶牛酮病早期预警指标的确立与评估

为了早期预测奶牛酮病的发生,在黑龙江省东、西部2个集约化牛场(均有250多头泌乳牛)随机选取产前15~2 d,分娩当天,产后2~15 d的奶牛为试验动物。通过检测试验牛血浆中葡萄糖(Glu)、β-羟丁酸(BHBA)和游离脂肪酸(NEFA)的浓度,了解产后奶牛酮病发生状况;通过检测试验牛产前和产后各肝功指标,阐明奶牛围产期肝功指标与酮病间的关系以及对产后酮病发生风险的预警作用。结果表明:酮病发病率在东部牧场为40%,在西部牧场为45.16%;两牧场产后奶牛的血浆谷草转氨酶(AST)、NEFA和BHBA的水平均显著高于产前奶牛并与酮病呈显著正相关,血浆Glu水平显著低于产前奶牛并与酮病呈显著的负相关。根据受试者工作特征曲线(ROC)分析确定了东部牧场的预警值为产前血浆AST69.5 U几、Glu4.16 mmo1/L、NEFA0.25 mmol/L、BHBA0.32 mmol/L。西部牧场预警值为血浆AST68.0 U/L、Glu3.97 mmol/L、NEFA0.27眦nol/L、BHBA0.43 mmol/L。结果显示,奶牛产前血浆NEFA、Glu、AST和BHBA指标超过预警值可作为奶牛发生酮病的早期风险预测依据。     

奶牛体况与血浆生化指标对酮病的风险预警

为探究奶牛体况、血浆生化指标与酮病的关系,试验选择黑龙江省某集约化牧场94头围产期奶牛进行跟踪调查,根据血浆β-羟基丁酸(BHBA)浓度分为酮病组(K组)和对照组(C组)。采用GLM模式、皮尔逊相关性、二元Logistic回归模型、受试者工作曲线(ROC)进行数据分析。结果表明:围产期奶牛体况评分(BCS)、血浆BHBA、游离脂肪酸(NEFA)、甘油三酯(TG)与奶牛酮病存在强相关性,奶牛分娩当天BCS3.625、血浆BHBA0.68 mmol/L、血浆NEFA0.78 mmol/L时,奶牛有患酮病的风险。     

围生期奶牛能量负平衡与免疫抑制的关系

为了探讨围生期奶牛能量负平衡与免疫抑制的关系,试验随机选取2个集约化牛场围生期奶牛各60头,以能量负平衡为判定标准,β-羟丁酸(BHBA) 1. 2 mmol/L、游离脂肪酸(NEFA)0. 4 mmol/L、葡萄糖(GLU)0. 3 mmol/L为发病组,BHBA 1. 2 mmol/L、NEFA 0. 4 mmol/L、GLU0. 3 mmol/L为对照组,对试验牛能量代谢指标、矿物质代谢指标、免疫功能指标进行组间独立样本t检验和Spearman相关性分析,并利用二元Logistic回归分析预测疾病,最后利用受试者工作特征曲线(ROC)分析确立分界值和诊断效果。结果表明:发病组奶牛血液中Ca、Mg、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)的水平和对照组奶牛相比差异极显著(P0. 01),发病组奶牛血液中C反应蛋白(CRP)、结合珠蛋白(HP)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平和对照组奶牛相比差异显著(P0. 05),并且发病组奶牛血液中的Ca、Mg水平低于对照组,IL-1、IL-2、IL-6、HP、CRP、TNF-α的水平高于对照组; IL-1、IL-2、IL-6、HP、TNF-α水平与BHBA浓度呈显著或极显著正相关(P0. 05或P0. 01),Ca水平与GLU浓度呈极显著正相关(P0. 01),IL-2、HP水平与GLU浓度呈显著负相关(P0. 05),Ca、P、Mg水平与NEFA浓度呈显著或极显著负相关(P0. 05或P0. 01),IL-2、HP、TNF-α水平与NEFA浓度呈显著正相关(P 0. 05);经二元Logistic回归分析确定Ca、IL-1、IL-2、IL-6、HP、TNF-α水平6项指标与围生期泌乳奶牛免疫抑制相关;经ROC分析确立了HP、TNF-α2项免疫抑制指标的预警值为HP 29. 49 ng/L、TNF-α219. 90 ng/L。     

BHBA对体外培养牛肝细胞氧化应激状态及抗氧化关键酶活性和mRNA表达的影响

评价氧化应激状态有助于理解奶牛代谢紊乱性疾病(如酮病等)的发病机制.本研究以牛肝细胞体外培养模型为基础,通过细胞培养液中添加不同浓度的β-羟丁酸(BHBA),运用分光光度方法和实时荧光定量PCR(realtime PCR)技术,分别测定细胞裂解上清液中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)的含量、总抗氧化能力(TCA)和过氧化氢酶(CAT)、总谷胱甘肽过氧化物酶(T-GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性,以及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达水平的变化.结果显示,随着BHBA浓度的增加,肝细胞中H2O2和MDA的含量呈剂量依赖性增加,添加BHBA 24 h后,各组H2O2和MDA的含量均显著高于0、12和48 h.各时间点TCA含量随添加BHBA浓度的增加而降低.添加BHBA 12 h后,低浓度组(0.6mmol/L BHBA)T-SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均显著高于对照组,高浓度组(1.2和2.4mmol/L BHBA)T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mRNA表达均低于对照组;添加BHBA 24、48h后,T SOD、T-GSH-Px和CAT的活性及CAT、GSH-Px、Mn-SOD和Cu/Zn SOD mR-NA表达均随BHBA浓度的增呈剂量依赖性抑制.结果表明,添加低浓度的BHBA可以维持体外培养肝细胞中氧化抗氧化系统的动态平衡,但高浓度BHBA影响该动态平衡,导致肝细胞处于氧化应激状态,引起氧化应激损伤,进而影响肝细胞的正常生理功能.     

血浆对氧磷酶1在奶牛酮病中的变化及其预测作用

为了早期预测奶牛酮病的发生,随机选取黑龙江某集约化牛场,产后14~21 d奶牛为试验动物。通过对氧磷酶1(PON1)、葡萄糖(GLU)、游离脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和谷草转氨酶(AST)的检测,阐明奶牛围产期PON1在奶牛酮病发生风险的预警作用。结果表明,酮病组较对照组奶牛血浆中PON1活性和含量显著下降。PON1含量、活性与GLU、BHBA、NEFA和AST均有显著相关性。根据受试者工作特征曲线(ROC)分析确定酮病预测值为血浆PON1含量46.79 nmol/L、GLU3.04 mmol/L、AST100 U/L、NEFA0.82 mmol/L。试验表明,PON1、GLU、AST和NEFA均可用作预测奶牛酮病发生风险的评估指标。     

β-羟丁酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂肪合成及其相关基因相对表达量的影响

本试验主要研究了不同浓度的β-羟丁酸(BHBA)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)活力、甘油三酯(TAG)含量、脂滴形成以及乳脂肪合成相关基因转录水平的影响。将传至第3代的BMECs悬液(1×105个/孔)接种于细胞培养板上,每孔加入含10%胎牛血清(FBS)的DM EM/F12培养液,于37℃的5%二氧化碳(CO2)培养箱培养48 h。再将培养48 h的BMECs随机分配到6个组,各组向培养孔中加入含不同浓度BHBA的DMEM/F12培养液,培养液中的FBS用1 g/L无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)代替,并使反应体系中BHBA的最终浓度分别为0(对照)、0.58、1.16、2.32、4.64和9.28 mmol/L。置于37℃的5%CO2培养箱继续培养48 h。试验结果显示:随着BHBA浓度的增加,BMECs活力[(相对增殖率(RGR)]呈显著的二次曲线增加(P=0.041),其中BMECs活力以0.58~4.64 mmol/L BHBA组较高,9.28 mmol/L BHBA组较低;低浓度(0.58~2.32 mmol/L)的BHBA可促进BMECs内脂滴的形成,而较高浓度(4.64~9.28 mmol/L)的BHBA对脂滴形成的促进作用减弱;BHBA与TAG含量及乳脂肪合成相关基因脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶α(ACACA)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)和分化抗原簇36(CD36)的相对表达量均无显著的一次线性或二次曲线关系(P0.05)。综上,BHBA对BM ECs活力的促进作用呈显著的二次曲线增加,即BHBA对BM ECs活力呈显著浓度依赖关系;BHBA对细胞内乳脂肪的合成有提高的趋势。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA表达的影响

为了阐明代谢产物在奶牛肝脂蛋白组装与转运过程中的调控作用,通过向体外培养的新生犊牛肝细胞添加非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖,采用内对照RT-PCR方法检测代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTP mRNA丰度的影响。结果显示,随着培养液中NEFA和葡萄糖浓度的升高,MTP mRNA的丰度呈现剂量依赖性上调(P<0.01);随着BHBA浓度的增加,MTP mRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05)。结果表明,NEFA和葡萄糖对肝细胞MTP mRNA表达具有促进作用,呈剂量依赖性:BHBA对肝细胞MTP mR-NA表达具有低剂量促进高剂量抑制的双重作用。     

添加胆固醇对非酯化脂肪酸介导的犊牛肝细胞脂质沉积的差异蛋白组成分析

为了研究胆固醇在非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid, NEFA)介导的犊牛肝细胞脂质沉积中的作用,揭示胆固醇对能量负平衡奶牛肝脂代谢的调控机制,采取体外分离培养犊牛肝细胞,添加NEFA的同时添加不同浓度(20、50和100 mmol/L)的胆固醇,模拟能量负平衡状态下的高NEFA环境,构建脂肪沉积模型。依据细胞生化指标的变化特征确定添加胆固醇的最佳浓度及时间,6 h后以最佳浓度胆固醇继续培养至12 h,确定胆固醇最佳处理时间;收集NEFA组(N组)以及最佳浓度和时间培养的胆固醇+NEFA(N+CHOL组)处理组犊牛肝细胞,利用同位素标记相对、绝对定量(iTRAQ)技术和生物信息学分析方法分析组间的差异蛋白。结果显示:通过对不同方法处理的各组细胞的生化指标进行对比,发现胆固醇处理的最佳浓度为50 mmol/L,最佳时间为6 h;组间差异蛋白共66个,其中有41个蛋白表达上调(比率≥1.2,P0.05),25个蛋白表达下调(比率≤0.83,P0.05),这些差异蛋白与黄体酮反应、雌二醇反应、生长激素反应和糖酵解过程有关,相关分子功能有胆固醇结合、钙依赖性蛋白结合、钙依赖性磷脂结合、和D-葡萄糖跨膜转运,其富集的主要代谢通路有Rap1信号通路、氨酰基-tRNA生物合成。     

代谢产物对犊牛肝细胞MTPmRNA丰度的影响

通过向体外-培养的新生犊牛肝细胞添加非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖,采用内对照RT-PCR方法检测代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞MTPmRNA丰度的影响.结果显示,随着培养液中NEFA和葡萄糖浓度升高,MTPmRNA的丰度呈现剂量依赖性上调(P<0.01);随着BHBA浓度的增加,MTPmRNA的丰度先升高后降低(P<0.01或P<0.05).表明,NEFA和葡萄糖对肝细胞MTPmRNA表达具有促进作用,呈剂量依赖性;BHBA对肝细胞MTPmRNA表达具有低剂量促进高剂量抑制的双重作用.     

p38介导β-羟丁酸对原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响

本试验旨在探讨β-羟丁酸（BHBA）对体外原代培养犊牛肝细胞凋亡的影响以及p38MAPK在其中的调控作用。选择培养72h的肝细胞,添加不同浓度的BHBA（0、0．6、1．2、2．4mmol／L）,培养9h,每个浓度3个重复。另外选取细胞,p38MAPK抑制剂SB203580（10pmol／L）预处理1h后,添加BHBA,使其终浓度为2．4retool／L;PI／An—nexinV—FITC双染,运用荧光显微镜观察肝细胞凋亡情况;ELISA法检测p38的活性;实时荧光定量PCR方法检测p38、Caspase-3、Caspase9、bcl2基因的mRNA表达水平。结果表明,与对照组相比,1．2和2．4mmol／I—BHBA组的肝细胞凋亡明显增加;p38酶活性明显升高;p38、caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平均显著增加（P〈0．01）。bcl2基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．05）;添加p38抑制剂后,caspase-3和caspase-9基因mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）,bcl-2基因mRNA表达水平显著增加（P〈O．05）。高浓度的BHBA可以诱导体外原代培养犊牛肝细胞凋亡,p38在BHBA诱导的细胞凋亡中发挥重要作用。     

肝功能指标与奶牛酮病的关系及其对酮病的预警作用

利用二元Logistic回归分析确立肝功能指标与奶牛酮病的因果关系;通过受试者工作特征(ROC)曲线确定葡萄糖(Glc)、游离脂肪酸(NEFA)、天门冬氨酸转移酶(AST)、胆碱脂酶(CHE)、直接胆红素(DBIL)和血中总胆红素(TBIL)对酮病的预警作用。从2012年4至6月,在中国黑龙江省某个采取自由卧栏、TMR饲喂,具有完善的牛场管理系统的集约化奶牛场,随机选取表面健康和酮病奶牛共60头,在产后14~21d之间清晨空腹采取血浆样品。奶牛血浆β-羟丁酸(BHBA)浓度超过1.20 mmol/L被归类为酮病状态。通过ROC分析确定酮病预测的临界值。结果显示:NEFA、AST、CHE和TBIL可作为预测酮病发生的有效指标,预警值分别为NEFA0.76 mmol/L,AST104.0 U/L,CHE139.5 U/L,TBIL3.25μmol/L;NEFA敏感度为64.5%、特异度为91.7%,AST敏感度为74.2%、特异度为85.4%,CHE敏感度75.0%、特异度59.4%,TBIL敏感度58.1%、特异度83.3%。结果表明:Glc、AST、CHE、TBIL、DBIL和NEFA与酮病紧密相关。与Glc和DBIL不同的是,AST、CHE、TBIL和NEFA可作为预测酮病发生的有效指标,并且一些肝功指标可以作为预测酮病发生的高风险指标。     

BHBA对HT22细胞中ACE表达的影响

生酮饮食(KD)已被证实具有神经保护作用,但其机制尚不明确。本试验以小鼠海马神经元HT22为细胞模型,利用2 mmol/Lβ-羟基丁酸酯(BHBA)对HT22细胞进行处理,通过荧光定量PCR,免疫蛋白印迹和信号通路阻断试验,观察BHBA对HT22细胞ACE表达的影响,并探讨参与调控的信号通路。结果表明,2 mmol/L BHBA可通过激活HT22细胞内GPR109A受体和ERK1/2信号通路进而增加HT22细胞中ACE的表达。     

高产奶牛产后卵巢静止血液临床病理学变化及其预警评估

选择黑龙江省2个牛场高产奶牛,在产后60~90d调查卵巢静止,检测发情和卵巢静止奶牛生殖激素,能量代谢,肝功能和矿物质等指标,通过Pearson相关分析、二元Logistic分析和ROC分析对牛场产后卵巢静止进行预警评估。结果显示:2个牛场(Ⅰ,Ⅱ)卵巢静止发病率分别为29.5%,47.2%,主要由于产后早期能量负平衡。2个牛场卵巢静止组与发情组相比,血浆中β-羟丁酸(BHBA)、游离脂肪酸(NEFA)和门冬氨酸氨基转移酶(AST)均显著的升高。牛场Ⅰ,当产后60~90d奶牛血浆中BHBA0.94 mmol/L、NEFA0.56 mmol/L、AST95.5U/L时;牛场Ⅱ,当奶牛产后60~90d血浆中BHBA1.00mmol/L、NEFA0.585mmol/L、AST103.5U/L时;奶牛患卵巢静止的风险增高。结果表明,奶牛产后发生的能量负平衡可扰乱奶牛发情周期的生殖激素分泌,是引起2个牛场奶牛产后卵巢静止的主要病因。奶牛泌乳早期血浆中NEFA、BHBA和AST等指标可用于产后卵巢静止的风险预警。     

非酯化脂肪酸对体外培养犊牛原代肝细胞中炎性因子表达及其活性的影响

在建立犊牛原代肝细胞体外培养模型的基础上,通过培养液中添加不同浓度的非酯化脂肪酸(Nonesterified fatty acids,NEFAs),运用实时荧光定量PCR和ELISA方法,测定NEFAs对肝细胞中炎性因子TNFα、IL-6和IL-1β的mRNA表达及其活性的影响。结果显示,NEFAs作用肝细胞9h后,与对照组相比,高浓度NEFAs(1.8mmol/L)组肝细胞中TNFα、IL-1β的mRNA表达水平显著增加(P<0.05),IL-6的mRNA表达水平在2.4mmol/L时极显著增加(P<0.01),低浓度NEFAs(0.6、1.2mmol/L)组肝细胞中TNFα、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05);并且TNFα、IL-1β的活性在NEFAs浓度达到1.8、2.4mmol/L显著高于对照组(P<0.01),且呈剂量依赖性作用,IL-6的活性在在NEFAs浓度达到1.8mmol/L显著高于对照组(P<0.01),在2.4mmol/L也高于对照组,但差异不显著。结果表明,高浓度NEFAs在一定程度上能引起或加剧奶牛肝细胞炎性反应,可能是导致产后奶牛肝功能炎性损伤主要因素。     

钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化调节作用研究

钙离子(Ca2+)参与哺乳动物精子获能、超激活运动和顶体反应等多个生理过程,但其作用机理尚未明确。本研究旨在探讨Ca2+在猪精子获能过程中对精子活力和蛋白磷酸化的影响及其作用机制。采用计算机辅助精子活力分析仪(CASA)及蛋白免疫印迹方法测定不同Ca2+浓度处理后精子活力参数及蛋白磷酸化水平变化,同时,利用细胞免疫荧光技术对不同处理组精子样品磷酸化蛋白进行细胞亚组分定位。CASA结果显示,随着Ca2+浓度增加,猪精子活力参数呈现先增加(1.0 mmol/L)后降低(3.0 mmol/L)的趋势;免疫印迹结果发现,低浓度钙离子(0.5 mmol/L)促进精子蛋白磷酸化,而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)显著抑制蛋白磷酸化;免疫荧光揭示,4.0 mmol/L钙离子处理组鞭毛处磷酸化蛋白明显少于未获能组和获能组;c AMP-PKA信号通路调节因子c AMP和IBMX以及钙调蛋白抑制剂W7和CZ均能有效缓解高浓度钙离子对猪精子蛋白酪氨酸磷酸化的抑制作用。结果提示,钙离子对猪精子活力及蛋白磷酸化起双重调节作用:即低浓度钙离子(0.5 mmol/L)有助于提高猪精子活力及蛋白磷酸化,高浓度钙离子(4.0 mmol/L)抑制精子活力和蛋白磷酸化;而高浓度钙离子(4.0 mmol/L)可能通过c AMPPKA信号通路和Ca2+/Ca M通路抑制鞭毛处与精子活力有关的蛋白(动力蛋白或轴丝蛋白)磷酸化,进而抑制精子活力。