塞内卡病毒A(SVA) VP1间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立快速检测塞内卡病毒A (Senecavirus A,SVA)血清学方法,以纯化的重组VP1蛋白作为包被抗原,建立了SVA VP1间接ELISA抗体检测方法。结果表明,VP1蛋白以包涵体形式表达,纯化后的蛋白经Western blot鉴定具有较好的反应原性。该ELISA检测方法阴、阳性临界值为0.278,与口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病原阳性血清均无交叉反应,具有良好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%,表明该方法重复性和稳定性均较好。相比于血清中和试验(SN),该方法的相对敏感性为98.0%,两种方法的符合率为84%。用该方法对来自山东、广东省的8个猪场的276份血清进行检测,阳性率为22.1%。SVA VP1间接ELISA抗体检测法可作为一种快速、简便的血清学诊断方法,用于猪群SVA感染监测和流行病学初步调查。     

IBRV重组gD蛋白的真核表达与间接ELISA检测方法的建立

通过优化牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）gD基因序列为Sf9细胞偏好密码子,转座形成穿梭载体,将质粒瞬时转染Sf9昆虫细胞,利用昆虫杆状病毒表达系统表达纯化重组IBRV gD蛋白;以制备的重组IBRV gD蛋白为包被抗原,建立检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法,并通过比对检测已知血清中和抗体效价的牛血清,验证所建立的间接ELISA方法的敏感性、特异性与重复性等指标。结果显示：本研究建立的间接ELISA方法对相关的牛病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:512,组内和组间变异系数均低于10%;使用建立的间接ELISA检测方法结合血清中和试验,对480份临床血清样品进行检测,发现两者敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。结果表明,本研究建立的检测IBRV血清中和抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可开发为临床适应的检测试剂盒。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒血清IgA抗体间接ELISA方法的建立

建立了检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,旨在为PEDV感染检测与免疫效果评价提供技术手段。以重组PEDV结构蛋白(S1蛋白)作为包被抗原,采用方阵滴定法确定抗原包被浓度、封闭液、稀释液以及待测血清和酶标抗体的最佳工作浓度,建立了PEDV IgA抗体检测间接ELISA方法。进而检测方法的特异性、批内与批间重复性,评价建立方法与国外试剂盒的符合率,分析ELISA检测血清特异性IgA抗体水平与中和抗体的相关性。结果显示,ELISA方法的最佳抗原包被浓度为1 mg/L,封闭液和抗体稀释液为含5%犊牛血清的PBS,待检血清和酶标抗体的工作浓度分别为1∶40与1∶1 500倍稀释。结果表明,该ELISA能够特异地检测PEDV抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型等病毒的抗血清无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数低于10%,与现有试剂盒的总符合率为94.8%,血清特异性IgA抗体水平与中和抗体呈正相关(r=0.69,P<0.001)。     

猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清特异性IgA抗体的间接ELISA方法,本研究利用融合PCR的方法,将PEDV G2型LNct2a株S蛋白的S1基因片段与人源IgG分子的Fc基因片段融合,克隆于真核表达质粒pAAV-IRES-hr GFP中,构建真核表达质粒pAAV-LNCT2-S1-Fc并转染293T细胞,表达并纯化了S1蛋白。以纯化的S1蛋白作为包被抗原,以羊抗猪IgA-HRP为二抗,通过优化反应条件,建立了检测PEDV G2型特异性IgA抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验。特异性试验结果显示该方法对猪传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒和圆环病毒的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示该方法能够检测出400倍稀释的阳性血清;批内和批间重复性变异系数均小于10%。利用该间接ELISA方法和间接免疫荧光方法(IFA)同时对临床样品检测,结果显示二者总符合率为98.6%。本研究建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够用于检测及评价血清中PEDV特异性IgA抗体的水平,为PEDV流行情况及免疫效果评价提供了有效的手段。     

猪圆环病毒2型IgM抗体间接ELISA的建立

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要原发性病原,其感染的早期检测有助于及时采取防控措施。以重组衣壳蛋白(Cap蛋白)作为包被抗原,通过对反应条件的优化,建立了PCV2 IgM抗体间接ELISA,其最适抗原包被浓度为1.25 μg／mL,最适血清稀释度为1∶100,临界值为0.35。该检测方法与其他5种常见猪疫病阳性血清无交叉反应,特异性良好。批内、批间重复试验的变异系数均在2%~6%,重复性好。对100份临床样本的检测结果表明,该检测方法与国外同类试剂盒相比,敏感性为90.3%,特异性为92.8%,总符合率为92%。试验结果表明,所建立的PCV2 IgM间接ELISA特异性好和敏感性高,适用于PCV2感染早期的流行病学调查。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。【方法】利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。【结果】重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂...     

猪繁殖与呼吸障碍综合症的防治(下)

(接上期)5.1.3血清学检查可用四种方法检测血清中的PRRS病毒抗体。免疫过氧化物酶试验(IPMA):本方法特异性和敏感性较好,但操作复杂、费用高;间接荧光抗体试验(免疫荧光染色法-IFA):本方法可最早于感染后6d,一般于感染后两周检出抗体,抗体效价于感染后5～6周达到峰值(1∶40000);血清中和试验(SN):因SN抗体比IFA出现得晚,所以本法对急性感染的检出率较低。Yoon氏等于1994年对本法进行了改进,加入了20%的新鲜猪血清,从而提高了本法的敏感性,可于感染后10d左右检出抗体;酶联免疫吸附试验(ELISA):本法的特异性比IPMA法更敏感,且操作…     

猪脑心肌炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

以猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)VP1重组蛋白为包被抗原,建立了检测EMCV血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA).经优化,获得间接ELISA的最佳反应条件为抗原包被浓度0.625 μg/mL,待...     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

Comparison of the pathogenic, antigenic and molecular characteristics of two encephalomyocarditis virus (EMCV) isolates from Belgium and Greece

The pathogenicity of two porcine encephalomyocarditis virus (EMCV) isolates for sows in gestation and young piglets was studied. One virus originated from a case of reproductive failure in pigs in Belgium and the other from a case of acute myocarditis in pigs in Greece. Sows in the mid-gestation period and one- to two-month old piglets were inoculated with each isolate. The molecular relationship between both isolates was studied by determining the nucleotide sequence located across the junction of the 1C and 1D capsid-coding genes. Antigenic analysis was performed using a panel of 35 monoclonal antibodies raised against an Italian field isolate of EMCV. All three approaches revealed differences between both isolates and also confirmed that there was no link between the two outbreaks of disease.     

猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析

采集临床疑似脑心肌炎死亡仔猪的组织作为接种材料,接种于BHK-21细胞系,观察细胞病变(CPE),并用RT-PCR和间接荧光抗体试验(IFA)进行鉴定,证实分离到1株脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV),命名为GXLC株。应用RT-PCR方法扩增GXLC株的3D基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的3D基因序列进行分析。序列分析结果表明,GXLC株3D基因全长1380 nt,编码460个氨基酸,含有7个抗原表位。同源性分析结果表明,GXLC株与国内外其它EMCV分离株3D基因核苷酸序列的同源性在84.7%~99.7%之间,氨基酸序列的同源性在96.1%~99.6%之间。遗传进化分析结果表明,基于3D基因核苷酸序列绘制的系统进化树可将所有EMCV分离株分成2个群:Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,而鼠源EMCV分布在Ⅰ群,人源EMCV分布在Ⅱ群;GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群。     

脑心肌炎病毒检测方法研究进展

脑心肌炎由脑心肌炎病毒(EMCV)引起,主要导致猪脑炎、心肌炎及母猪的繁殖障碍,该病的发生与流行严重影响我国养猪业的发展。论文综述了各种EMCV检测方法及其优缺点,为更有效的EMCV检测方法的建立提供参考。     

猪脑心肌炎病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其识别表位分析

为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。     

猪脑心肌炎病毒感染对iNOS mRNA转录水平的影响

为研究iNOS在猪脑心肌炎病毒(EMCV)致病机制中的作用,本研究将猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠、仔猪,观察临床症状和病理变化,检测心、脑组织中iNOS mRNA转录水平。试验结果表明,小鼠和仔猪感染EMCV后均出现明显的临床症状、剖检及组织病理学变化显示心、脑组织的病理炎症分值显著增加;心、脑组织中的iNOS mRNA转录水平显著上调,并且转录水平上调的峰值与感染小鼠、仔猪出现明显临床症状、严重病理损害及小鼠死亡高峰存在明显的时间相关性,与心、脑组织的病理炎症分值成线性正相关。表明组织中iNOS的过量表达与感染动物的发病和死亡密切相关,iNOS在EMCV致病机制中发挥重要作用。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株的分离及其3D基因分子特征的分析

采集临床疑似脑心肌炎死亡仔猪的组织作为接种材料,接种于BHK-21细胞系,观察细胞病变（CPE）,并用RT-PCR和间接荧光抗体试验（IFA）进行鉴定,证实分离到1株脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）,命名为GXLC株。应用RT-PCR方法扩增GXLC株的3D基因,扩增产物克隆入pMD18-T载体后进行测序,对获得的3D基因序列进行分析。序列分析结果表明,GXLC株3D基因全长1380 nt,编码460个氨基酸,含有7个抗原表位。同源性分析结果表明,GXLC株与国内外其它EMCV分离株3D基因核苷酸序列的同源性在84.7%～99.7%之间,氨基酸序列的同源性在96.1%～99.6%之间。遗传进化分析结果表明,基于3D基因核苷酸序列绘制的系统进化树可将所有EMCV分离株分成2个群：Ⅰ群和Ⅱ群,Ⅰ群可再细分为Ⅰa亚群和Ⅰb亚群,其中猪源EMCV在Ⅰ群和Ⅱ群中均有分布,而鼠源EMCV分布在Ⅰ群,人源EMCV分布在Ⅱ群;GXLC株与其它中国分离株均属于Ⅰa亚群。     

猪脑心肌炎病毒GXLC株VP1基因的原核表达及鉴定

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)GXLC株的基因组序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增EMCV VPl基因目的片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建了EMCV VPl基因重组表达质粒pET-32a-VP1.将pET-32a-VP1转化BL21(DE3)株感受态细胞,并用IPTG进行诱导表达.结...