小麦β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆与酵母表达

超长链脂肪酸是生物体内众多重要物质的合成底物。KCS基因编码β-酮脂酰CoA合成酶,该酶具有底物特异性,参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应,是超长链脂肪酸合成的限速步骤。为了探究小麦KCS基因在超长链脂肪酸合成中的功能,采用同源克隆的方法从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆出KCS基因后,利用生物信息学对其编码序列进行分析,并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对其进行真核表达。结果表明,小麦TaKCS6基因的开放阅读框为1 287bp,编码428个氨基酸残基。结构域预测结果显示,TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III结构域,属于KCSs蛋白家族。序列比对分析结果显示,TaKCS6氨基酸序列与拟南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在两个功能结构域上和活性位点保守。酵母表达结果显示,TaKCS6基因编码的蛋白参与C24以上超长链脂肪酸的延伸。     

大豆长链脂酰辅酶A合成酶基因GmLACS在酵母中的表达

在LACS缺陷型酵母YB525中对已经克隆的大豆长链脂酰辅酶A合成酶基因(GmLACS)进行表达,并对其功能进行了预测.进化树比对分析显示大豆长链脂酰辅酶A合成酶(GmLACS)与其它植物的LACSs具有高度的同源性;酵母互补测试显示GmLACS蛋白能够互补LACS缺陷型酵母YB525,具有长链脂酰辅酶A合成酶活性;底...     

玉米KCS基因家族的生物信息学分析

蜡质可作为植物生长过程中抵御逆境的第一道 “防护墙” ，其主要成分是超长脂肪酸(Very Long ChainFatty Acids， VLCFAs)的衍生物。β-酮脂酰 CoA合成酶(β Ketoacyl-CoA Synthase， KCS)参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应，此反应是超长链脂肪酸合成的限速步骤，决定 VLCFAs的合成速率及碳链的长度。拟南芥 KCS基因家族成员及功能已被鉴定，但玉米 KCS基因家族成员及功能仍不清楚。根据拟南芥 KCS蛋白序列和保守结构特征，对比鉴定出 39个玉米 KCS蛋白，并对其结构域、蛋白质理化性质、组织特异性表达等做出分析。结果表明，玉米 KCS基因家族成员含有相似的保守结构域，按照系统发育将 KCS基因家族成员划分 9个亚家族，该基因家族分布在 9条染色体上。玉米的KCS基因表达模式各不相同，不同玉米KCS基因可能在不同时期表达而调控不同组织的发育。     

碱蓬转录组分析及油脂合成相关基因表达模式

碱蓬（Suaeda salsa）籽粒具有较高的含油量及丰富的不饱和脂肪酸,作为潜在的特种油料作物具有极高的开发和利用价值。为了全面研究碱蓬中油脂合成相关基因的构成及表达模式,本文利用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对碱蓬根、叶和发育期种子进行转录组检测和分析,筛选碱蓬发育期种子和叶片转录组中参与油脂合成途径的关键脂类基因,并对其差异表达模式进行了比较分析。本研究测序共计产出106 647条Unigenes,通过与各蛋白数据库比对,其中76 755条Unigenes成功获得了功能注释。共有45个Unigenes编码参与脂肪酸（FA）合成的关键酶,其中25个Unigenes在发育期种子中上调表达;多个编码ACCase、KASⅢ和EAR等的Unigenes上调表达;且7个编码酰基载体蛋白去饱和酶（SAD）的Unigenes中有5个在发育期种子中显著上调,可能与碱蓬油脂中不饱和脂肪酸的生成相关。共有30个Unigenes编码参与三酰甘油（TAG）合成的关键酶,其中16个Unigenes在发育期种子中上调表达,包括多个编码GPAT和DGAT的Unigenes。本研究对解析碱蓬脂类代谢途径的调控模式及发掘参与碱蓬油脂合成的关键基因具有重要的意义和参考价值。     

碎米荠CarKCS基因全长CDS克隆、序列分析及表达载体构建

根据KCS基因的保守性设计引物,以高神经酸含量的碎米荠叶片DNA为模板(KCS基因无内含子),克隆碎米荠超长链脂肪酸合成的限速酶β-酮脂酰- CoA合酶(KCS)基因全长CDS序列,命名为CarKCS.Blast 比对及序列分析表明,目的片段序列和GenBank上报道的拟南芥KCS18序列同源性达到87％.CarKCS全长1518bp,不含内含子,编码505个氨基酸.生物信息学分析表明,所有的酶功能活性位点的氨基酸都存在,在N端都有两个,C端有一个高度疏水的跨膜结构域;CarKCS与KCS18同属于KCS基因家族的FAE1 - like亚家族.将目的片段连接到pFCC -5941.nap表达载体,经PCR和酶切检测,证明已成功构建了pNapin- CarKCS载体.     

茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和序列分析

从茶树叶片中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,分别用三对PCR引物扩增SAM合成酶基因的中间主片段、 3 端和 5 端片段 ,最后经BLAST比较及重叠区域拼接得到完整的SAM基因序列。所得序列长 130 3bp ,编码 394个氨基酸。与中华猕猴桃、番茄、长春花SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为 87% ,83 %和 83%。氨基酸序列与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列的同源性为 92 %～ 90 %。证实所获得的基因序列为茶树SAM合成酶基因     

小麦LACS基因家族的全基因组鉴定与表达分析

长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-coenzymeA synthetase, LACS)在脂肪酸代谢、角质层角质和蜡的合成中发挥着重要作用。为研究小麦中LACS基因的特征,以中国春为材料,进行全基因组鉴定和分析。结果共鉴定出148个小麦LACS基因(TaLACS),不均匀分布于21条染色体上,且有成簇分布的现象,编码蛋白大部分为中性、亲水的水溶性蛋白,性质稳定。系统进化分析结果显示,148个TaLACS基因聚为6组,有55对旁系同源基因。表达谱分析表明,TaLACS基因在不同组织和逆境胁迫下存在明显的差异表达,说明TaLACS基因具有组织特异性,在抗低温、干旱和赤霉病过程中TaLACS基因发挥重要作用。该家族中含有响应低温、干旱和脱落酸元件的基因分别占34.9%、46.0%和85.8%,揭示TaLACS基因参与生物胁迫和非生物胁迫过程。     

香蕉ACC合成酶cDNA的PCR扩增及序列测定

从香蕉果实中提取总ＲＮＡ,经反转录成ｃＤＮＡ第一链,根据已知植物ＡＣＣ合成酶的ｃＤＮＡ及其所编码的氨基酸序列合成引物,经ＰＣＲ扩增香蕉ｃＤＮＡ得到一长约１．１Ｋｂ的产物,对该序列测定结果表明,该ｃＤＮＡ所编码的氨基酸序列包括了ＡＣＣ合成酶８个高度保守区中的７个,并且包括该酶的活性中心。     

红麻酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)酵母双杂交诱饵载体构建及自激活检测

酮脂酰辅酶A合成酶(KCS)是超长链脂肪酸合成过程中的限速酶,参与超长链脂肪酸和蜡质的合成,在植物抗旱和应对生物胁迫反应中发挥重要调控作用。研究采用PCR方法从红麻中(茎皮)分离KCS基因片段,将该基因按正确方式插入酵母双杂交表达质粒pGBKT7中,酶切鉴定正确后,用PEG/Li Ac方法转化酵母MaV203,经抗性筛选后,用X-Gal对转化酵母进行自激活检测。结果表明,KCS基因的DNA结合结构域与酵母GAL4转录因子的上游激活位点(UAS)结合,可激活报告基因半乳糖苷酶的表达。经删除KCS基因DNA binding区域后重新转化酵母,结果表明,不携带KCS基因DNA binding区域的截短蛋白可以作为诱饵蛋白来研究与之相互作用的蛋白。     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。