转GFM Cry1A基因玉米自交系及其杂交种的抗螟性鉴定

对获得的6个转GFM Cry1A基因玉米(zea mays)株系的T5代PCR分析证明,转基因株系是稳定遗传的.以此抗虫系为亲本与常规自交系配制了四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt3个杂交种.转基因自交系和杂交种的抗螟性鉴定结果表明:转基因系间抗虫性差异极显著,同一转基因系单株间也存在差异.抗螟性强的4个株系比受体对照平均蛀孔数减少70%、茎秆虫孔隧道长度减少80%、存活的虫体长度减少70%,差异显著,达到了高抗水平.对6个转基因抗虫系进ELISA检测,毒蛋白表达量平均占总蛋白0.16%,最高的达0.19%.杂交组合四密25Bt、通单24Bt和吉单209Bt群体内平均虫孔隧道长度与常规杂交种对照相比,分别减少39.97%、36.2%和53.83%,平均减少43.36%,抗虫性明显提高.农艺性状鉴定结果显示,转基因系配制的杂交种与对照在株高、穗长、穗行数、行粒数和百粒重上无显著差异.研究认为,Bt基因可用于玉米的抗螟性改良,为转基因抗虫玉米自交系能够直接用于玉米杂交种改良提供了依据.     

糯玉米单倍体诱导及其加倍研究

以吉诱101为父本诱导11份糯玉米材料,研究花丝长度、授粉时期对糯玉米单倍体诱导率的影响,比较不同处理方法对糯玉米单倍体的加倍效果。结果表明,糯玉米单倍体平均诱导率,长花丝时期授粉为13.47%,短花丝时期授粉为5.75%;伏后期授粉为12.86%,伏期授粉为6.22%。加倍试验结果表明,平均散粉率,浸芽法(10.66%)浸根法(6.20%)浸种法(4.34%)自然加倍法(1.05%),其中,浸芽法加倍效果最好。     

21份玉米单倍体诱导系遗传背景及诱导率分析

为明确改良和应用不同血缘背景诱导系,本研究选用21个外引及自选诱导系,采用基于Geno Plexs多重PCR的1K SNP标记进行基因分型并应用层次聚类法进行类群划分,同时以先玉335和3份糯玉米杂交种为母本进行杂交诱导,用以评判诱导系的诱导能力。结果表明,21份诱导系被划分为3类血缘,分别是Stock6为代表的类群Ⅰ、吉诱101代表的类群Ⅱ和农大高诱系列代表的类群Ⅲ;类群Ⅱ平均诱导率显著高于类群Ⅲ和类群Ⅰ,自选系WY7在选育过程中相比于背景诱导系产生了诱导率增益,WY7和W7-4可用于诱导糯玉米。     

耐盐碱转基因玉米的获得及其抗性分析

依据Gen Bank数据库中发表的拟南芥DREB基因序列进行优化,人工合成DREB基因序列,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法将DREB基因转入玉米自交系Hi II中,获得转DREB基因玉米材料,经过分子检测获得4个阳性转化事件。在不同浓度水平的Na Cl溶液(40、80、120 mmol/L)和Na_2CO_3溶液(10、20、30 mmol/L)胁迫下,研究其耐盐碱性。结果表明,DREB基因已经整合到玉米基因组中,转DREB基因玉米的耐盐碱性获得显著提高,80 mmol/L的Na Cl溶液和20 mmol/L Na_2CO_3溶液可以作为转DREB基因玉米的耐盐碱分析条件。     

玉米茎尖导入SAG_(12)基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性,用农杆菌介导法将耐盐碱基因SAG12转入玉米中,获得110株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得21株转基因植株。进一步进行PCR检测,其中14株表现阳性,转化率达12.73%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

基因枪共转化法获得玉米转基因植株的研究

通过基因枪共转化方法将磷高效利用phy基因、钾高效利用AlHAK1基因和筛选标记bar基因等外源基因导入玉米自交系H99的1 500块愈伤组织中。经PCR分析,获得79株阳性植株,其中53株为AlHAK1阳性,49株为phy阳性,23株为AlHAK1和phy阳性,单基因转化率为5.27%,双基因转化率为1.53%,共转化整合比率达到29.11%。     

农杆菌介导玉米遗传转化体系的研究

为了提高玉米自交系的遗传转化率，建立农杆菌介导玉米遗传转化体系。通过农杆菌菌株EHA105侵染玉米自交系7922的胚性愈伤组织，以β-葡萄糖苷酶基因(GUS)为报告基因研究几种因素对遗传转化体系的影响。结果表明：（1）当农杆菌浓度OD600=0.6时，GUS瞬时表达率最高为35.3%；（2）当侵染时间为15 min时，GUS瞬时表达率最高为37.3%；（3）当共培养时间为3天和恢复培养时间为4天时，GUS瞬时表达率最高为29.1%。因此选择农杆菌浓度OD600=0.6，侵染时间15 min，共培养3天和恢复培养4天，为最佳遗传转化条件。通过优化影响遗传转化体系的因素，初步建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

转基因抗虫玉米Bt毒蛋白的时空表达分析

对2个转Bt基因玉米抗虫系株系进行Bt毒蛋白表达量的分析测定。结果显示,转基因株系中的毒蛋白可以在其后代稳定的遗传和表达,毒蛋白的表达为组成性表达,在玉米的各个发育时期和植株的各个部位均有表达,但其表达的量有显著差异,毒蛋白表达量随着植株的生长而减少,比较植株的各个器官,叶片毒蛋白含量最高,茎次之,根、种子和花丝中的毒蛋白含量较少。     

农杆菌介导的玉米合子基因转化

本研究建立了农杆菌介导的玉米合子转化方法。用农杆菌介导合子转化方法，以含有bar基因的标准双元载体PTF102和含有bar基因和双价抗虫基因Cry1A（a）或Cry1A（c）、PTA（半夏凝集素）的载体p3300-Bt-pta转化玉米自交系吉8902、丹340、吉4112、吉853、铁7922及PA91，直接从受体植株得到转化种子，用除草剂PPT筛选和PCR鉴定，获得转基因植株及后代。实验分析了2002年、2003年和2004年的3批转化操作的结实率、转化率及转基因的遗传情况：经农杆菌侵染的雌穗平均结实率为39％，合子转化频率达1％以上，转基因可以遗传下去。农杆菌介导玉米合子转化方法可以重复获得成功，表明我们成功建立起一个新的不依赖组织培养的玉米转基因技术体系。