宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化调控肌动球蛋白解离作用机制

【目的】研究宰后肌肉中肌球蛋白磷酸化与肌动球蛋白解离之间的关系,分析其磷酸化水平的变化对肌动球蛋白解离的影响,探究肌球蛋白磷酸化对宰后肌肉肌节长度与嫩度的作用。【方法】取宰后30 min内的羊背最长肌,在4℃条件下分别成熟6、24、48和72 h,通过SDS-PAGE电泳、Pro-Q染色和蛋白质免疫印迹测定肌球蛋白的磷酸化水平和肌动球蛋白解离程度随宰后时间的变化;测定肌动球蛋白ATP酶的活性,分析宰后不同时间点肌球蛋白与肌动蛋白结合作用力的强弱;采用透射电镜分析宰后肌节长度随时间的变化。【结果】研究发现宰后肌肉中肌球蛋白轻链2的磷酸化水平在0.5—48 h快速降低(P0.05),并在48 h达到最低点,在48—72 h有所升高(P0.05),但其最终磷酸化水平明显低于初始值。肌动球蛋白的解离程度在宰后初期(0.5—6 h)显著降低(P0.05),在6—48 h显著升高(P0.05),并于48—72 h维持稳定,其最终解离程度显著高于宰后0.5 h的初始值。肌动球蛋白ATPase活性在宰后初期(0.5—6 h)略有升高,6—24 h快速上升(P0.05),并在24 h达到最高点,24—72 h逐渐降低;而肌节长度的变化则与之相反,呈先下降后上升的趋势,并在24 h达到肌节最短点。【结论】羊宰后肌肉中的肌球蛋白轻链2磷酸化水平的变化对肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用有较大的影响,且肌节收缩(肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用力)与肌动球蛋白的解离(肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用量)并不是一个同步的进程。肌球蛋白轻链2的磷酸化修饰负向调控肌动球蛋白解离和肌动球蛋白ATPase活性,导致肌节的收缩与舒张,进而调控肉品最终的嫩度。     

冰温贮藏对羊肉中蛋白质磷酸化水平的影响

【目的】通过测定冰温贮藏及冷藏过程中肌肉肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的磷酸化水平,分析冰温贮藏对蛋白质磷酸化水平的影响,为肉类冰温贮藏品质调控提供理论依据。【方法】选取大尾寒羊与小尾寒羊杂交公羊的背最长肌于冷藏和冰温条件下成熟,分别在0.5 h、12 h、24 h、3 d、5 d、9 d取样测定蛋白激酶活性、肌浆蛋白与肌原纤维蛋白的磷酸化水平。采用蛋白激酶活性测定试剂盒、运用酶联免疫的方法检测各处理组蛋白激酶的活性随贮藏时间的变化;通过SDS-PAGE电泳、荧光染色的方法得到全蛋白染色与磷酸化染色的肌浆蛋白与肌原纤维蛋白条带,运用Quantity One软件分析各处理组各处理时间的肌浆蛋白及肌原纤维蛋白的磷酸化水平。【结果】贮藏初期(0.5—12 h),冰温组蛋白激酶活性显著升高(P0.05),冷藏组蛋白激酶活性则显著降低(P0.05),贮藏12 h—9 d过程中,冰温组蛋白激酶活性均显著高于冷藏组(P0.05)。两处理组蛋白激酶活性均随贮藏时间的延长而逐渐降低,且冰温组蛋白激酶活性均显著高于冷藏组(P0.05)。对肌浆蛋白染色效果图中分布于15—250 k Da的17个蛋白条带逐一进行分析,结果表明贮藏温度极显著影响肌浆蛋白各蛋白条带的磷酸化水平(P0.001)。冷藏组肌浆蛋白整体磷酸化水平先升高后降低,贮藏第3天达到最大值,冰温组肌浆蛋白整体磷酸化水平先降低后升高,最小值出现在贮藏第24天,贮藏第12天至3天时,冷藏组肌浆蛋白整体磷酸化水平高于冰温组(P0.05),贮藏第9天时,冰温组肌浆蛋白整体磷酸化水平高于冷藏组(P0.05)。对肌原纤维蛋白染色效果图中分布于15—250 k Da的20个蛋白条带逐一进行分析,结果表明不同贮藏温度对所有肌原纤维蛋白条带的磷酸化水平均产生极显著影响作用(P0.001)。两处理组肌原纤维蛋白整体磷酸化水平均随贮藏时间的延长呈现先升高后降低的趋势,冷藏组与冰温组最大值分别出现在24 h和12 h,贮藏初期(0.5—12 h),两处理组间肌原纤维蛋白整体磷酸化水平无显著差异(P0.05),贮藏24 h至贮藏期结束,冷藏组肌原纤维蛋白整体磷酸化水平始终高于冰温组(P0.05)。【结论】冰温贮藏通过影响蛋白激酶的活性来调控蛋白质的磷酸化水平,进而通过影响糖酵解途径、肌肉收缩及骨架蛋白降解来间接调控肉品质。     

Aurora-A抑制对猪卵母细胞MⅠ期纺锤体组装的影响

[目的]本试验旨在探究Aurora-A抑制对猪卵母细胞成熟和纺锤体组装的影响及潜在机制。[方法]猪GV期卵母细胞分组进行体外成熟培养,在各组中分别添加0、1、3和5μmol·L~(-1)Aurora-A特异性抑制剂MLN8054,观察其对卵母细胞发育与成熟的影响及纺锤体结构的变化;免疫印迹检测磷酸化Aurora-A和TACC3的表达。[结果]Aurora-A抑制导致猪卵母细胞成熟明显受阻(P0.05),且主要阻滞在Pro-MⅠ期及MⅠ期;MⅠ期纺锤体形态明显异常,出现单极或多极纺锤体,异常率显著上升(P0.05)。Aurora-A抑制后,猪卵母细胞磷酸化Aurora-A和酸性卷曲转化相关蛋白3(TACC3)表达水平显著下降(P0.05)。[结论]MLN8054处理后,猪卵母细胞减数分裂进程和纺锤体组装受阻,并抑制了磷酸化Aurora-A和其下游蛋白磷酸化TACC3的表达。     

PP1γ2对昆明小鼠精子成熟和运动性的调控作用

【目的】PP1γ2是一种特异表达于动物睾丸和精子的蛋白磷酸酶,为精子发生、运动性获得与调控所必需的关键酶,本文对PP1γ2与昆明小鼠精子成熟和运动性调控进行研究。【方法】通过Western-blot技术,分析昆明小鼠不同条件下附睾头和附睾尾精子中磷酸化和非磷酸化PP1γ2的蛋白质表达量,探讨磷酸酶抑制剂okadaic acid (OA)和cyliculin A (CA)对附睾头和附睾尾精子运动度的影响。【结果】附睾尾精子中磷酸化PP1γ2的蛋白水平远远高于附睾头精子的(P0.05);db-cAMP、IBMX和Ca~(2+)不改变磷酸化PP1γ2的蛋白水平;OA和CA能显著提高附睾头和附睾尾磷酸化PP1γ2的表达水平,且能显著提高精子(尤其是附睾头的精子)运动度。【结论】PP1γ2通过磷酸化和去磷酸化作用,其酶活性发生变化,从而对昆明小鼠附睾精子成熟和运动性进行调控,即在附睾头精子中PP1γ2酶活性较高,精子运动度较低;在附睾尾精子中PP1γ2酶活性较低,精子运动度得到显著提高。     

AMPK调控运动骨骼肌能量代谢的研究进展

AMPK参与了运动中骨骼肌葡萄糖、糖原、脂肪酸及蛋白质等主要能源物质的代谢调节,其调节机制涉及数十种下游靶。AMPK能促使GLUT4转位入肌膜,也可调节GLUT4基因表达而促进葡萄糖的摄取和氧化;抑制糖原合成酶活性及激活磷酸果糖激酶而抑制肌糖原合成和促进分解;磷酸化并灭活ACCβ及激活MCD促进脂肪酸氧化;抑制mTOR信号通路和eEF2在翻译水平上抑制蛋白质合成。     

支链氨基酸和胰岛素对大鼠骨骼肌细胞蛋白质代谢的分子调控机制研究

[目的]研究支链氨基酸(BCAA)对大鼠骨骼肌细胞蛋白质代谢的影响,探讨氨基酸转运载体在BCAA调控细胞蛋白质代谢途径中的作用机制。[方法]用缺失支链氨基酸(Leu-,Ile-,Val-)的无血清高糖型DMEM培养液培养L6肌管细胞,先后在培养基质中添加100 nmol·L-1雷帕霉素、支链氨基酸(Leu+,Ile+,Val+)和胎牛胰岛素,RT-PCR法检测细胞表面氨基酸转运载体LAT1、CD98和SNAT2以及氨基酸调控因子GCN2和ATF4 mRNA表达,并结合Western-blot法考察蛋白合成关键因子磷酸化S6K1蛋白表达量及蛋白降解关键因子MuRF1和MAFbx mRNA表达水平。[结果]BCAA依赖于m TOR途径显著促进磷酸化S6K1(Thr389)蛋白表达(P0.05),此过程与提高LAT1和CD98的mRNA表达水平(P0.05)有关。SNAT2在胰岛素参与下,其表达量显著增加(P0.05),并依赖于m TOR途径;BCAA对GCN2和ATF4 mRNA水平没有产生显著影响,但能够依赖m TOR途径显著提高ATF4蛋白表达量(P0.05);在没有胰岛素参与下,BCAA未能够引起MuRF1和MAFbx表达发生变化,但在胰岛素协同下,BCAA能够使MAFbx表达显著下降(P0.05),但该抑制效应并不能被雷帕霉素所阻断;无胰岛素下MuRF1和MAFbx表达量显著高于胰岛素参与下的表达量(P0.05)。[结论]BCAA不依赖胰岛素调控蛋白质合成代谢,通过细胞膜氨基酸转运受体(LAT1、CD98和SNAT2)介导,作用于m TOR途径发挥促进蛋白合成作用;胰岛素使BCAA的促蛋白合成作用更加明显;BCAA调控蛋白质分解代谢过程依赖胰岛素,与胰岛素协同抑制蛋白降解。     

赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究

为研究赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)诱导自噬的信号通路机制,通过药物的特异性抑制信号通路中不同激酶的活性,探讨特异性激酶抑制剂在OTA诱导的自噬及猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)复制促进中的作用。结果表明:1)OTA能够抑制PCV2感染猪肾细胞株(PK-15)中的蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的活性,从而增强自噬能力;2)胰岛素能够逆转OTA引起的AKT与mTOR磷酸化水平的降低,能够逆反OTA诱导产生的自噬以及PCV2的复制促进;3)OTA能够激活细胞外信号调节激酶1/2(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路;4)ERK1/2的抑制剂(U0126)通过降低ERK1/2的磷酸化水平,从而抑制了OTA诱导的自噬及PCV2的复制促进;5)U0126能够减少OTA引起的mTOR磷酸化水平降低的幅度。     

磷酸化水平对肌红蛋白稳定性的影响

【目的】肌红蛋白是影响肉色最主要的色素物质,主要存在于肌浆中,其绝对含量和3种肌红蛋白(氧合肌红蛋白、脱氧肌红蛋白、高铁肌红蛋白)间的相对含量决定了肉色。已有研究表明蛋白质的磷酸化可能会通过对糖酵解代谢途径以及肌红蛋白的调控进而负向调控肉色的稳定性,本研究旨在探究磷酸化对肌红蛋白稳定性的影响,进而为通过调控磷酸化水平提高肉色稳定性提供理论依据。【方法】用连二亚硫酸钠还原骨骼肌肌红蛋白纯品,再经超滤除去连二亚硫酸钠。随后采用碱性磷酸酶(AP)体外孵育催化肌红蛋白的去磷酸化反应,采用SDS-PAGE凝胶电泳和Pro-Q与Ruby染色的方法测定肌红蛋白磷酸化水平的变化,测定孵育体系pH的变化,紫外分光光度计测定孵育过程中3种肌红蛋白相对含量的变化,圆二色谱测定孵育过程中肌红蛋白的二级结构变化。【结果】磷酸化水平的测定结果表明,碱性磷酸酶处理组(去磷酸化处理)中肌红蛋白的磷酸化水平在孵育6 h时显著低于对照组(P0.05),表明碱性磷酸酶可以在体外孵育过程中催化肌红蛋白发生去磷酸化反应,降低肌红蛋白的磷酸化水平。3种肌红蛋白相对含量的测定结果表明,从孵育2 h起,碱性磷酸酶处理组中氧合肌红蛋白的相对含量显著高于对照组,高铁肌红蛋白的相对含量显著低于对照组。即与对照组相比,碱性磷酸酶处理组中肌红蛋白的自动氧化速率低,氧化还原稳定性高(P0.05)。pH的测定结果表明,碱性磷酸酶处理组和对照组孵育体系的pH差异不显著(P0.05),即添加碱性磷酸酶进行孵育没有改变孵育体系的pH。二级结构的测定结果表明,肌红蛋白的二级结构以α-螺旋为主。从孵育0 min到6 h,碱性磷酸酶处理组中肌红蛋白的α-螺旋和β-折叠的含量基本不变,而对照中肌红蛋白的α-螺旋含量增加,β-折叠的含量减少,表明碱性磷酸酶处理组中肌红蛋白二级结构的稳定性高于对照组。【结论】肌红蛋白发生磷酸化修饰后,可能会通过改变肌红蛋白的二级结构,降低肌红蛋白二级结构的稳定性,增加肌红蛋白的自动氧化速率,进而加速高铁肌红蛋白的积累,不利于肉色稳定性,这可能是蛋白质磷酸化负向调控肉色稳定性的原因之一。     

腺苷对大鼠心肌原蛋白I及磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用

用差速离心及等密度离心法从大白鼠心肌细胞中分离收缩蛋白质及质膜,分别与[γ-~(32)P]ATP 保温,观察细胞成分的磷酸化,以及腺苷或腺苷类似物对磷酸化的影响.结果表明,在收缩蛋白质组分,~(32)P 主要掺入肌原蛋白Ⅰ(TroponinⅠ,29000Da);在质膜组分、~(32)P主要掺入磷脂酰肌醇-4-—磷酸(PtdIns-4-P);也就是 ATP 使磷脂酰肌醇(PtdIns)磷酸化。腺苷对此两种磷酸化都有抑制作用,尤以对PtdIns 的磷酸化抑制作用最强。cAMP 对肌原蛋白Ⅰ的磷酸化有刺激作用,这与文献报道相符.作者认为腺苷和 cAMP 对肌原蛋白Ⅰ磷酸化的拮抗作用,与腺苷和肾上腺素对心肌调节的拮抗作用有明显的相关性。鉴于近年发现肌醇磷脂转换在调节细胞活动中起有重要作用,腺苷对磷脂酰肌醇磷酸化的抑制作用,可能具有重要的生物学意义。     

高脂日粮对初情期小鼠乳腺发育的影响及分子机制

【目的】研究高脂日粮对初情期小鼠乳腺发育的影响及可能机制。【方法】选用20只4周龄昆明雌性小鼠,设对照组和高脂日粮组,试验期4周,每周称体质量并统计采食量。试验结束后采集小鼠乳腺并称质量,采用wholemount及HE染色观察小鼠乳腺组织形态结构及导管数量。利用Western blot检测初情期小鼠乳腺组织胰岛素样生长因子1(Insulin-like growth factor1,IGF-1)、增殖相关信号通路关键蛋白蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、胞外调控的蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinase,Er K)以及炎症信号通路关键蛋白Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和核因子κB激酶抑制剂(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)的表达。【结果】高脂日粮组小鼠采食量极显著低于对照组(P0.01),但在能量摄入方面与对照组无显著差异。高脂日粮组小鼠的体质量增加显著高于对照组(P0.05)。高脂日粮组小鼠在乳腺质量、乳腺质量与体质量的比值上均极显著高于对照组(P0.01)。乳腺组织的whole-mount及HE染色结果表明,高脂日粮组小鼠乳腺导管发育明显被抑制,其乳腺组织的导管数和密度明显降低,乳腺组织的终末乳芽数量也极显著低于对照组(P0.01)。高脂日粮能够显著抑制小鼠乳腺组织IGF-I的蛋白表达以及Akt、Erk和IKK的磷酸化水平(P0.01或0.05),极显著促进小鼠乳腺组织TLR4的蛋白表达(P0.01)和显著促进JNK的磷酸化水平(P0.05)。【结论】高脂日粮能够抑制初情期小鼠乳腺发育,这可能是通过抑制乳腺增殖的相关信号和促进乳腺组织炎症的相关信号来实现。     

蛋白质磷酸化调控羊肉肌原纤维蛋白的功能

【目的】通过激活蛋白激酶的活性提高羊肉肌原纤维蛋白的磷酸化水平,分析磷酸化水平的提高对羊肉肌原纤维蛋白降解程度、收缩功能的影响,进一步揭示蛋白质磷酸化对羊肉肌肉嫩化的作用机理。【方法】通过添加蛋白激酶A激活剂Forskolin、蛋白激酶C激活剂佛波酯（PMA）,提高蛋白激酶的活性,改变羊肉肌原纤维蛋白的磷酸化水平。比较激活剂处理组与空白对照组肌原纤维小片化指数（MFI）、条带降解程度、肌节长度等指标的差异,确定蛋白质磷酸化水平对羊肉肌肉收缩和肌肉降解的影响。【结果】将羊肉样品在蛋白激酶溶液中培养24 h,在培养结束后1、2和4 h,PMA处理组（PKC激活组）的蛋白激酶活性显著高于空白对照组（P＜0.05）,而在培养后1和4 h,Forskolin处理组（PKA激活组）的蛋白激酶活性显著高于空白对照组（P＜0.05）。PMA处理组和Forskolin处理组的最高蛋白激酶活性出现在培养后1 h。Forskolin和PMA通过提高激酶活性显著提高肌联蛋白（Titin）、肌球蛋白结合蛋白C（Myosin binding protein C）、原肌球蛋白（Tropomyosin）、肌球蛋白轻链2（Myosin light chain 2）等蛋白质的磷酸化水平,肌球蛋白重链、肌动蛋白质的磷酸化水平没有显著变化,Forskolin组和PMA组的蛋白质降解程度及肌节长度均低于对照组。【结论】肌原纤维蛋白磷酸化水平提高不利于羊肉肌原纤维蛋白的降解。另一方面,磷酸化水平可能通过对肌球蛋白轻链2的作用增强羊肉肌肉的收缩作用力,通过促进相邻原肌球蛋白的相互作用促进肌细丝收缩,影响肉的僵直进程和嫩化进程。     

宰后不同时间滩羊肉抗氧化活性的变化及可能机制

【目的】探究宰后不同时间滩羊肉抗氧化活性的变化,并从游离氨基酸、蛋白质组角度阐释其机制,为生鲜羊肉的品质保持提供数据支持。【方法】选取6只6月龄健康舍饲滩羊公羊（（18.30±1.41）kg）,在宰后0.5、3、6、12和48 h取背最长肌,测定铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）、2, 2-联氮基双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（2, 2-azinobis-(3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonate),ABTS）自由基清除能力、2, 2-二苯代苦味酰基苯肼（2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力、氧自由基吸收能力（oxygen-radical absorbance capacity,ORAC）、N, N-二甲基-对苯二胺（N, N-dimethyl-p-phenylendiamine,DMPD）总抗氧化能力、游离氨基酸含量和蛋白质组变化。【结果】宰后48 h内,滩羊肉中FRAP总抗氧化能力呈先下降后上升趋势,ABTS自由基清除能力呈先升高后趋于稳定趋势,DPPH、DMPD自由基清除能力和ORAC整体均呈现上升趋势;宰后48 h滩羊肉中FRAP总抗氧化能力、ABTS、DPPH、DMPD自由基清除能力和ORAC显著高于宰后0.5 h和3 h水平（P<0.05）;宰后不同时间点滩羊肉中游离氨基酸总含量差异不显著（P>0.05）,但胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸的含量在不同时间点存在显著性差异（P<0.05）,且总体呈现增加的趋势。与FRAP呈显著正相关关系的游离氨基酸有7个,包括邻磷酸丝氨酸（r=0.489,P<0.01）、亮氨酸（r=0.566,P<0.01）、酪氨酸（r=0.596,P<0.01）、异亮氨酸（r=0.374,P<0.05）、苯丙氨酸（r=0.499,P<0.01）、赖氨酸（r=0.375,P<0.05）和精氨酸（r=0.376,P<0.05）;其中,亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著正相关关系（P<0.05）。蛋白组学鉴定筛选出宰后不同时间滩羊肉中差异蛋白20个,与FRAP显著相关的差异蛋白有12个（P<0.05）,钙蛋白酶抑制蛋白和未知蛋白2与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著负相关关系（P<0.05）,而糖原蛋白1和蛋白激酶结构域蛋白与FRAP、ABTS、DPPH、ORAC、DMPD均呈现显著正相关关系（P<0.05）。【结论】滩羊肉抗氧化能力的升高与宰后肌肉中亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等游离氨基酸的释放有关。宰后初期肌肉中钙蛋白酶抑制蛋白、未知蛋白2等蛋白表达量的下降和糖原蛋白1、蛋白激酶结构域蛋白等蛋白表达量的上升与宰后滩羊肉抗氧化能力的变化显著相关。     

Trolox对猪肌肉干细胞增殖及分化的影响

【目的】探究抗氧化剂-水溶性维生素E的类似物（Trolox）通过调控活性氧对猪肌肉干细胞增殖及分化过程产生的影响,为进一步优化培养肉种子细胞在体外增殖及分化过程提供研究基础。【方法】首先在猪肌肉干细胞增殖过程中,添加不同浓度（0、50、100和200 μmol∙L^-1）的Trolox培养3 d,利用血细胞计数板进行细胞计数,统计细胞增殖倍数,同时利用CCK8技术检测不同浓度的Trolox对细胞增殖的影响;利用RT-qPCR技术检测不同浓度Trolox处理后表征干性的PAX7表达水平,Western Blotting技术检测PAX7蛋白的表达水平;通过CellROX荧光染料对细胞内活性氧进行染色并通过高通量高内涵活细胞共聚焦成像系统检测Trolox对活性氧的调控作用;进一步在猪肌肉干细胞体外成肌分化进程中添加Trolox处理,利用RT-qPCR技术检测分化早期标志基因MYOG、CAV-3及终末分化标志基因肌球蛋白重链（MyHC）的表达水平,并利用Western Blotting技术检测MyHC蛋白的表达,利用免疫荧光技术对MyHC进行染色并统计MyHC阳性细胞比例。【结果】细胞增殖倍数统计显示,50和100 μmol∙L^-1的Trolox处理组猪肌肉干细胞增殖倍数显著高于对照组（P<0.05）;CCK8测得50和100 μmol∙L^-1 Trolox处理组第3天的吸光值显著高于对照组（P<0.05）;100和200 μmol∙L^-1的Trolox显著上调了PAX7的表达（P<0.05）,对PAX7蛋白的表达有上调趋势,但无显著差异（P>0.05）;添加Trolox后,细胞内活性氧水平被极显著降低（P<0.001）;在分化进程中添加Trolox后,预分化阶段的MYOG和CAV-3及终末分化阶段的MyHC均显著上调（P<0.05）,而Western blotting结果显示MyHC蛋白的表达无显著变化（P>0.05）;免疫荧光结果显示MyHC阳性细胞比例有增多的趋势,但无显著差异（P>0.05）。【结论】Trolox通过降低细胞内的活性氧,促进猪肌肉干细胞的增殖以及分化进程。     

琅琊鸡及其配套系蛋壳质量、钙代谢生化指标和钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达的比较

【目的】探讨影响琅琊鸡及其配套系蛋壳质量和钙代谢的差异因素,为琅琊鸡品种资源保护及开发提供理论依据。【方法】选取240日龄琅琊鸡及其浅麻羽色、深麻羽色配套系各180只,各品系随机分为6个重复,每个重复30只,在相同饲养条件下饲养至300日龄时各重复随机收集鸡蛋30枚,各重复随机选取6只,翅下静脉采集血样、屠宰后收集左腿胫骨及十二指肠、蛋壳腺、肾脏等组织样,用于检测蛋壳质量、钙、磷相关指标及钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA的表达量。【结果】浅麻羽色配套系的蛋重显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而蛋壳重低于其他品系（P>0.05）;另外,蛋壳厚度和蛋壳比率显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳强度显著高于其他品系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的蛋黄、蛋壳、胫骨中钙含量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,蛋壳、胫骨中磷含量显著高于其他品系（P<0.05）;蛋壳中灰分含量浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,而胫骨中灰分含量和胫骨重浅麻羽色配套系最高,其次为琅琊鸡、深麻羽色配套系,品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的体重、胫骨长度显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）;浅麻羽色配套系的血钙、降钙素含量显著低于其他品系,而浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素含量显著高于其他品系,且品系间均差异显著（P<0.05）;浅麻羽色配套系的钙结合蛋白含量显著低于深麻羽色配套系（P<0.05）,而两个配套系的骨钙素显著高于琅琊鸡（P<0.05）;浅麻羽色配套系的十二指肠部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达量显著高于其他品系（P<0.05）,而蛋壳腺部位表达量显著高于深麻羽色配套系（P<0.05）,肾脏部位钙结合蛋白表达量显著高于琅琊鸡（P<0.05）。【结论】在240—300日龄产蛋期,浅麻羽色配套系的血磷、碱性磷酸酶、甲状旁腺素、骨钙素等相关活性物质及十二指肠、肾脏、蛋壳腺部位钙结合蛋白CaBP-D28k mRNA表达水平高于其他品系,可能促进其小肠上段对钙磷的吸收和骨钙的释放、转运能力,影响蛋黄、蛋壳中矿物质的沉积和改善蛋壳、胫骨质量。     

伏马毒素B1对猪体外成熟卵母细胞凋亡与自噬的影响

[目的]探究伏马毒素B,(fumonisin B1,FB1)对猪卵母细胞体外成熟的影响及其潜在的作用机制,为临床有效防治FB1所致的生殖毒性损伤提供理论参考.[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)进行随机分组,在体外成熟培养过程中分别用不同浓度FB1(0、10、...     

姜黄素通过Nrf2信号通路对H2O2诱导奶牛乳腺上皮细胞氧化应激的缓解

【目的】验证姜黄素是否能够通过转录因子E2相关因子2（Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）信号通路减轻H₂O₂诱导的奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激,为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的氧化损伤提供理论依据。【方法】培养奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,用500 μmol·L^-1H₂O₂处理MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h;MAC-T细胞转染Nrf2 siRNA 48 h后,用500 μmol·L ^-1 H₂O₂处理奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T细胞24 h后加入不同浓度的姜黄素（0、5、15或30 μmol·L^-1）处理3 h。采用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和试剂盒等方法,检测Nrf2的蛋白表达量及下游靶基因NAD（P）H醌氧化还原酶1（NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1）和血红素加氧酶1（Heme oxygenase 1,HO-1）的mRNA及蛋白表达量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）等氧化应激相关指标的活性及含量。【结果】（1）H₂O₂处理组MAC-T细胞中MDA含量显著高于对照组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著低于对照组（P<0.01）。15 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组和30 μmol·L^-1姜黄素+H₂O₂共同处理组MAC-T细胞中MDA的含量显著低于H₂O₂处理组（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著高于H₂O₂处理组（P<0.05,P<0.01）。（2）H₂O₂处理组总Nrf2蛋白水平显著低于对照组（P<0.01）,H₂O₂处理组Nrf2下游基因HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著低于对照组（P<0.01）。姜黄素处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）,姜黄素处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于对照组（P<0.01）。姜黄素+H₂O₂处理组总Nrf2蛋白表达水平显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）,姜黄素+H₂O₂处理组HO-1和NQO1的mRNA及蛋白表达量也显著高于H₂O₂处理组（P<0.01）。（3）si-Nrf2组与对照组相比,Nrf2的mRNA表达水平显著降低（P<0.01）。si-Control+H₂O₂+姜黄素组与si-Control+H₂O₂组相比,MDA的含量显著降低（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px的活性显著升高（P<0.01）。si-Nrf2+H₂O₂+姜黄素处理组与si-Control+H₂O₂+姜黄素组相比,MDA的含量显著升高（P<0.01）,而CAT、SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.01）。【结论】姜黄素可以通过增加Nrf2的表达,诱导下游抗氧化分子的转录从而缓解H₂O₂诱导奶牛乳腺上皮细胞的氧化应激。本研究为防治围产期奶牛代谢紊乱导致的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤提供理论依据。     

两种微生物菌剂对有机基质袋培秋黄瓜产量、品质及根际环境的影响

【目的】探究甲基营养型芽孢杆菌和植物乳杆菌两种微生物菌剂对有机基质培黄瓜产量、品质及根际环境的影响,开发新型功能型微生物制剂,指导黄瓜优质高效生产。【方法】以‘博耐526’黄瓜品种为材料,采用有机基质袋培方式,在浇灌清水（N）和营养液（F）2种养分水平下,以不添加菌剂为对照（分别记为CK1和CK2）,于定植后第20、35和50天按2.5×10¹⁰CFU/株的菌剂用量分别灌根添加‘VL-10’型甲基营养型芽孢杆菌（NT1、FT1）和‘LYS-1’型植物乳杆菌（NT2、FT2）两种菌剂,共6个处理。【结果】两种养分水平下,与CK1和CK2处理相比,甲基营养型芽孢杆菌处理植株的干物质积累量增幅分别为13.51%和15.02%,产量增幅分别为20.83%和15.63%;植物乳杆菌处理植株干物质积累量增幅分别为11.43%和8.42%,产量增幅分别为17.42%和14.96%,甲基营养型芽孢杆菌对植株干物质积累和产量形成的促进效果优于植物乳杆菌。以FT1处理的果实品质最优,其游离氨基酸、有机酸、可溶性糖、还原糖和维C含量分别较CK2处理显著提高了10.61%、28.93%、22.92%和39.88%（P<0.05）,FT2处理的果实品质次之;NT1和NT2处理较CK1处理显著提高了植株P（7.43%和13.50%）、K（10.60%和8.19%）元素积累量（P<0.05）,FT1和FT2处理的植株N（19.57%和24.18%）、P（17.16%和12.50%）、K（16.48%和26.25%）元素积累量均较CK2处理显著提高（P<0.05）;FT1处理的N、P、K肥料利用率较CK2处理分别显著提高了82.85%、483.90%和75.60%（P<0.05）,FT2处理分别显著提高了102.42%、367.98%和120.46%（P<0.05）。NT1和NT2处理较CK1处理提高了盛果期的基质蔗糖酶（100.66%、116.60%）、过氧化氢酶（3.39%、4.10%）和碱性磷酸酶（6.99%、95.08%）活性,其中过氧化氢酶和碱性磷酸酶活性在拉秧期依然高于CK1处理;而FT1和FT2处理均较CK2处理显著提高了盛果期和拉秧期的基质脲酶（3.75%、4.95%和13.13%、6.12%）、蔗糖酶（68.62%、24.93%和31.68%、63.35%）和碱性磷酸酶活性（18.00%、26.99%和109.64%、84.01%）（P<0.05）,且甲基营养型芽孢杆菌对脲酶和碱性磷酸酶的影响优于植物乳杆菌;两种养分水平下,甲基营养型芽孢杆菌处理的基质有效态氮含量在盛果期分别较CK1和CK2显著提高了63.33%和72.70%（P<0.05）,在拉秧期增幅为25.48%和86.46%,同时期增幅均大于植物乳杆菌,有利于保持更高的基质有效态氮含量。【结论】灌根添加7.5×10¹⁰CFU/株的甲基营养型芽孢杆菌和植物乳杆菌均可改善有机基质袋培黄瓜的根际环境,促进植株对元素的吸收、同化和积累,有效提高黄瓜产量和果实品质,以甲基营养型芽孢杆菌的增产提质效果更优。     

硒对S. aureus诱导的奶牛乳腺上皮细胞Nod2/MAPK/mTORs信号通路关键蛋白表达的影响

【目的】硒（Se）能否通过Nod2/MAPK/mTOR途径调控金黄色葡萄球菌诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤,有待于进一步研究。因此本研究将探究硒对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染的奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键蛋白表达的影响,从而为阐明硒的免疫调控机制提供理论依据。【方法】首先将bMECs以10 ⁶细胞/孔接种于6孔板中,当细胞超过80%的汇合度时,用含2、4和8 μmol·L ^-1浓度硒的培养基替换原来的培养基,继续孵育12 h,然后用PBS洗涤每孔3次,将S. aureus按MOI=1:1的比例加入6孔板中,继续培养0.5 h,然后收集bMECs细胞进行相关蛋白的检测。本试验共分3大组,即对照（Con）组（bMECs）、模型（Mod）组（bMECs+S. aureus）和试验组。其中试验组又分3个亚剂量组,即Low组（bMECs+2 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）、Mid组（bMECs+4 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）和Hig组（bMECs+8 μmol·L ^-1 Se+S. aureus）,每组设3个重复。利用BCA蛋白测定试剂盒对收集的bMECs细胞进行总蛋白提取。应用Western blotting技术检测bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平。将蛋白样品加到10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中,上样量为20 μg/孔,之后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5 mL 5%脱脂乳阻断2 h,脱脂乳脱脂后用TBST清洗后,分别用5 mL的 Nod2、RIP2、JNK、AKT、mTOR和β-actin的一抗孵育过夜,回收一抗。之后在PVDF膜中分别加入5 mL上述蛋白的二抗,室温孵育2 h,回收二抗。PVDF用TBST洗涤5次,最后在暗室条件下进行化学显影。 【结果】S. aureus能显著提高bMECs中Nod2和RIP2蛋白表达水平及JNK,AKT和mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.01）。S. aureus感染0.5 h后,Nod2蛋白水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加2 μmol·L ^-1 的硒可极显著抑制Nod2蛋白的表达（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒可显著抑制Nod2的表达（P<0.05）; S . aureus感染0.5 h后,RIP2蛋白水平显著升高（P<0.05）,而在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制RIP2蛋白的表达（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组JNK蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.05）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 的硒能显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）; S. aureus感染0.5 h后,与对照组相比,模型组AKT蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里添加4 μmol·L ^-1 硒可极显著抑制JNK蛋白的磷酸化水平（P<0.01）,在培养基里添加8 μmol·L ^-1 硒可显著抑制AKT蛋白的磷酸化水平（P<0.05）;S. aureus感染0.5 h后,模型组mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.01）。在培养基里分别添加4 μmol·L ^-1 和8 μmol·L ^-1 硒均能显著抑制mTOR蛋白磷酸化水平（P<0.05）。 【结论】硒可通过抑制bMECs Nod2/MAPK/mTORs信号通路中关键因子蛋白的表达而减轻S. aureus诱导的bMECs炎症反应。     

相对饲养水平对绵羊肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响

【目的】提高肉品质是现代肉羊生产的主要目标之一,研究不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构及肌纤维组成相关基因的影响,为通过饲养水平调控肉脂型绵羊肉品质,提高生产效益提供参考。【方法】选择出生日龄接近（（3.0±0.5）月龄）、体况良好、体重相近（（19.16±0.54）kg）、臀型一致的阿勒泰羊30只,随机分为3组,自由采食60 d后,分别按照50%（0.25 MJ/W^0.75×d^-1）（NL组）、100%（0.5 MJ/W^0.75×d^-1）（NM组）、150%（0.75 MJ/W^0.75×d^-1）（NH组）的维持代谢能饲喂30 d后屠宰,取背最长肌分别进行苏木精—伊红(H.E.)染色和2%醋酸铀-枸橼酸铅双染色法染色,光学显微镜和透射电镜观察肌肉组织结构,并通过免疫组化法测定肌球蛋白重链I (myosin heavy chain,MyHC I)和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（preoxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ）蛋白表达量。【结果】(1) 阿勒泰羊摄入50%、100%和150%的维持代谢能时,三组试验羊的平均日增重分别为-90.67 kg、13.33 kg和203.00 kg,差异显著(P<0.05);背最长肌肌纤维直径NH组、NM组显著大于NL组（P<0.05）;肌内膜厚度NH组显著小于NL组（P<0.05）;肌束肌纤维数量、肌束纤维面积、肌束膜厚度以及肌纤维面积、肌纤维密度差异不显著（P>0.05）。(2) 饲养水平对肌质网终池面积、脂滴面积以及肌质网终池、肌原纤维、肌质的面积比都有影响,肌质网终池面积和面积比NH组显著大于NM和NL组（P<0.05）,脂滴面积NH组显著大于NL组（P<0.05）;肌质面积比NM组显著大于NH和NL组（P<0.05）;线粒体、糖原三组之间无显著差异（P<0.05）。(3) 饲养水平对肌纤维组成相关基因蛋白的表达有影响,PPARγ的蛋白表达强度、阳性面积和阳性率NL和NM组显著低于NH组（P<0.05）;MyHCⅠ蛋白表达强度随能量摄入水平的增加而增大,但是三组间差异不显著（P>0.05）。【结论】不同饲养水平对阿勒泰羊背最长肌肌肉组织结构和肌纤维类型相关基因蛋白的表达具有显著的影响,在育肥期可通过饲养水平控制肌肉组织结构和肌纤维类型组成,从而按照生产需要调控肉品质。