Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究

为获取微生物源溶栓药物,从土壤中获得产纤溶酶活性较高的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-3。从Z-3菌株的发酵液中提取纤溶酶,利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化。分离纯化得到1个单一组分(BSFE-1),SDS-PAGE电泳检测为单一条带,BSFE-1表观分子量为48 kDa,等电点为10.5,属丝氨酸蛋白酶类,纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性BSFE-1的比活力为4 494.099 U/mg,BSFE-1在4~50℃和pH 4~11之间活性较稳定。     

草鱼卵中蛋白酶抑制剂的初步分离及性质研究

[目的]草鱼卵匀浆液中纯化获得蛋白酶抑制剂。[方法]采用Sephadex凝胶层析技术和发色底物检测,经分离与纯化获得具有专一性抑制活性的蛋白酶抑制剂。在不同温度(30～100℃)和酸碱(pH 2～11)条件下研究该抑制剂稳定性。[结果]从草鱼卵中分离到表观分子量50 kD的蛋白酶抑制剂,其对胰蛋白酶的最低抑制浓度约为500μg/ml,抑制常数为14.6 nmol/L。该蛋白酶抑制剂还具有高度的热稳定和酸碱稳定性。[结论]该研究可为淡水鱼卵的高效利用提供理论依据。     

暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离及其生化特性鉴定

采用30%～50%饱和度的硫酸铵沉淀、凝胶层析脱盐及聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,再通过直接切胶后用回收槽电洗脱回收的方法,从暗诱导衰老小麦叶片中分离得到了1种耐热的蛋白水解酶.该酶具有良好的热稳定性,且表现出相当宽的pH稳定范围.该酶的最适温度为50 ℃,最适pH为8.分离得到的酶液在0～60 ℃处理1 h后,酶活性无明显变化,70 ℃处理1 h后仍有部分活性.酸性蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂都不能抑制该蛋白水解酶的活性,但丝氨酸蛋白酶抑制剂能部分抑制该酶的活性.     

暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离及其生化特性鉴定

采用30%～50%饱和度的硫酸铵沉淀、凝胶层析脱盐及聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,再通过直接切胶后用回收槽电洗脱回收的方法,从暗诱导衰老小麦叶片中分离得到了1种耐热的蛋白水解酶.该酶具有良好的热稳定性,且表现出相当宽的pH稳定范围.该酶的最适温度为50 ℃,最适pH为8.分离得到的酶液在0～60 ℃处理1 h后,酶活性无明显变化,70 ℃处理1 h后仍有部分活性.酸性蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂都不能抑制该蛋白水解酶的活性,但丝氨酸蛋白酶抑制剂能部分抑制该酶的活性.     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

小麦叶片中1种降解Rubisco大亚基的蛋白酶鉴定

[目的]探明小麦叶片衰老过程中1种降解1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)大亚基蛋白酶的生化特性.[方法]通过天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳后切胶回收的方法获得Rubisco全酶,采用离子交换层析、非完全变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和切胶回收蛋白等方法分离目的蛋白酶,并采用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究其生化特性(主要是最适pH、最适温度、热稳定性、蛋白酶类型等).[结果]切胶回收的Rubisco全酶样品中存在降解大亚基的蛋白酶.在Mono-Q离子交换层析条件下,该蛋白酶与Rubisco不易分离.利用非完全变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离出这种降解大亚基的蛋白酶;在聚丙烯酰胺凝胶中,该蛋白酶相对分子质量大于大亚基相对分子质量,位置在大亚基上方,其余部分没有检测到蛋白酶活性.该酶的最适温度为60℃;最适pH值为7.0,在pH 5.0～ 8.0均表现出较高的活性;该酶热稳定性一般,在50℃以上几乎完全丧失其活性;丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF[4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride]可以完全抑制蛋白酶活性,金属蛋白酶抑制剂1,10-phenanthroline可以部分抑制该蛋白酶的活性,酸性蛋白酶抑制剂pepstatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64[transepoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butane]、金属蛋白酶抑制剂EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)和EGTA[ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid]以及丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)不抑制该蛋白酶的活性.[结论]在切胶回收的Rubisco全酶中发现了1种可以降解Rubisco大亚基的蛋白酶,其可能是1种需要金属离子的丝氨酸型蛋白酶.     

鲤鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的初步研究

利用凝胶层析法从鲤鱼(Cyprinus carpio)卵中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及其特异底物,建立比色法检测,对初步分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性进行了分析。结果表明,丝氨酸蛋白酶抑制除对胰凝乳蛋白酶无抑制作用外,对其他的蛋白酶均有抑制效果;当温度超过70℃时,丝氨酸蛋白酶抑制剂失活,但在pH 2~11均保持活性,具有较强的酸碱稳定性。     

大蒜蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究

以大蒜为原料,经酸性溶液提取、盐析、脱盐、洗脱、凝胶过滤等步骤分离得到蛋白酶抑制剂AS-1。对该抑制剂理化性质进行分析,结果表明:蛋白酶抑制剂AS-1是一种分子量约为3 000、具有较高热稳定性、可溶于水的弱酸性蛋白质。     

辣椒疫霉菌致病毒素的纯化及其致病性的研究

通过硫酸铵沉淀法提取到疫霉菌的原始毒素。采用甜椒叶片注射法检测毒素的活性。采用两种方法对原始毒素进行纯化,用连续Bio-gel P-100柱层析法纯化能将毒素提至层析纯。在离子交换一分子筛层析法中,原始毒素依次经DEAE52-cellulose→CM32-cellulose→Sephadex G-75柱层析纯化后,经电泳检测为单一条带,说明达到电泳纯。采用SDS—PAGE法测定毒素的分子量为41．9ku。对毒素的组分进行了测定,结果表明毒素中蛋白质含量为70．4％,糖含量为29．6％。毒素经蛋白酶K和胰蛋白酶处理后活性均下降,而用β-葡萄糖苷酶处理后活性变化不大,说明蛋白质亚基在P.capsici毒素活性中起着主要作用。     

脱毛碱性蛋白酶的纯化及其生化特性研究

采用CM-阳离子交换层析和凝胶过滤层析分离碱性蛋白酶,得到了碱性蛋白酶的单一组分。对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)碱性蛋白酶SDS-聚丙烯酰胺电泳进行了分析。结果表明：其亚基分子量约为28kD,等电点约为8．4。并对其生化特性质进行研究,结果表明：酶活最适温度为45℃,最适pH值为10．5,在0．5mol／L的Na^ 对酶活有较大的促进作用。     

米糠蛋白的特性及提取工艺

主要研究在稀碱条件下米糠蛋白的提取工艺及所得蛋白的理化特性,确定了合理的工艺并优化了工艺参数.在此工艺条件下,米糠蛋白的提取率可达36%,纯度可达75%.SDS-PAGE分析结果表明米糠蛋白组成成分复杂,其相对分子质量分布主要集中在10 000～90 000之间.     

绿豆萌发过程中蛋白组分及亚基变化

【目的】探索不同萌发时期绿豆分离蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量的动态变化规律,以及蛋白质组分（分离蛋白、球蛋白和清蛋白）的亚基组成及含量变化,为绿豆蛋白的加工利用提供科学依据。【方法】采用等电点沉淀法提取绿豆分离蛋白,并根据Osborne分类法制备绿豆清蛋白、谷蛋白、球蛋白和醇溶蛋白,比较分析萌发前后绿豆分离蛋白及各蛋白组分含量的变化,同时通过SDS-PAGE电泳进一步分析萌发前后蛋白亚基组成及数量的变化。【结果】随着萌发时间的延长,绿豆分离蛋白的含量呈现先增高后下降的趋势,萌发36 h时与未萌发的绿豆相比提高了9.4%。绿豆清蛋白含量随着萌发时间的延长呈逐渐下降的趋势,萌发84 h时含量最小,为20.47 mg·g^-1。球蛋白随着萌发时间的延长呈现先升高后下降的趋势,萌发48 h时其含量最大,且比未萌发时提高了3.47倍。萌发对绿豆醇溶蛋白的含量变化影响不大。绿豆谷蛋白含量在萌发12-36 h和48-72 h变化无明显差异,但相对于未萌发的绿豆仍有一定程度的提高。绿豆蛋白酶活性在萌发36 h后不断上升,变化相对较大,72 h时开始下降。SDS-PAGE电泳图及光密度扫描分析结果发现,绿豆分离蛋白主要由7条条带组成（Ⅰ-Ⅶ）,萌发过程中各条带相对含量不断减少,随着萌发时间的延长,分子量在25-66 kD的条带含量逐渐降低,分子量在18-25 kD的亚基条带含量在萌发的前72 h有所增加,萌发至96 h时几乎只剩下Ⅳ条带。绿豆清蛋白主要由4条条带组成（Ⅰ-Ⅳ）,分子量分别为61.56、48.99、29.88和20.42 kD,萌发过程中条带Ⅰ相对含量从0 h的18.4%降至60 h的16.4%,萌发72 h后条带Ⅰ消失;条带Ⅱ在萌发过程中始终存在,但是含量不断减少;条带Ⅲ和条带Ⅳ也在萌发过程中不断减少,萌发72 h后消失。同时,分子量为18-25 kD的亚基条带相对含量在24-60 h增加,萌发至72 h逐渐消失,几乎只剩下条带Ⅱ。绿豆球蛋白主要由5条条带组成（Ⅰ-Ⅴ）,分子量分别为66、61、50、32和26 kD。萌发过程中亚基条带Ⅰ和Ⅱ都在萌发96 h时消失;而条带Ⅲ在萌发过程前期（0-60 h）相对含量逐渐增大,为34.4%-41.8%,萌发72 h后条带Ⅲ含量迅速下降,萌发至96 h时仅为10.8%;亚基条带Ⅳ和Ⅴ萌发至84 h后消失。分子量在18-25 kD的亚基条带在萌发24-60 h时有所增加,随着萌发时间的延长,出现降解甚至消失。【结论】适当萌发能提高蛋白的含量,促进大分子亚基发生水解,同时有利于小分子亚基或多肽生成,但萌发时间过长并不完全利于蛋白的利用。     

新生仓鼠肾细胞热激蛋白SDS凝胶电泳分析

对经继代培养后的新生仓鼠肾细胞(BHK)进行热冲击应答实验后,用SDS聚丙烯酰胺凝胺电泳技术分辨出热激蛋白,并测定了热激蛋白的分子量。本文还讨论了不同提取溶液,对热激蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳行为的影响。     

刺五加叶多糖的分离纯化及免疫活性研究

研究刺五加叶水溶性多糖结构信息和免疫活性。采用热水提取、乙醇沉淀、Sevag法脱蛋白后得到刺五加粗多糖,粗多糖经EDAE-SepharoseFastFlow离子交换柱和SephadexG-75凝胶过滤柱2次纯化,得到均-多糖组分ASP-2—1;ASP-2—1经三氟乙酸水解、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）衍生化、毛细管区带电泳法（CZE）测定其单糖组成;高效凝胶渗透色谱法测定其纯度和分子量;体外脾淋巴细胞增值试验测定其免疫活性。从刺五加叶中分离纯化得到的均-多糖组分SPA-2—1主要由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、木糖等6种单糖组成,摩尔比为27．33：8．92：3．03：1：7．59：20．51,其分子量为13．6KD;小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明,SPA-2—1可显著促进脾淋巴细胞的增殖,刺五加叶多糖SPA-2—1具有较强的体外免疫活性。     

南京小麦梭条花叶病毒RT—PCR的分子鉴定

采自江苏省南京市郊区的小麦病毒病样品提纯后 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结果表明 ,病毒外壳蛋白 (CP)为单一组分 ,相对分子质量为 36 5× 10 3 。经 1 2g·dL-1琼脂糖凝胶电泳检测 ,病毒核酸有两个组分 ,即RNA1和RNA2。根据AnbeSohn发表的小麦梭条花叶病毒RNA 13′端部分核苷梭序列 ,设计一对引物 ,以提纯样品的RNA1为模板 ,经RT PCR扩增出包含CP基因在内的 1 7kb的特异性目的片段 ,据此鉴定所采集的毒原为小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)。     

Molecular weight of human gamma interferon is similar to that of other human interferons

The molecular weight (as determined by molecular sieve chromatography) of human gamma interferon, formerly referred to as immune or type II interferon, is between 40,000 and 70,000. On sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, gamma interferon activity was recovered mainly from two regions of the gels corresponding to molecular weights of 20,000 and 25,000. The results suggest that in native form human gamma interferon may be aggregated.     

牛脑钙调素的分离纯化、鉴定及其免疫原制备

[目的]从牛脑中分离纯化钙调素(CaM),并进行生化鉴定,同时用碳二亚胺法制备CaM偶联免疫原.[方法]以phenyl-Sepharose层析法从牛脑中分离纯化CaM,用PDE法检测其活性,以SDS-PAGE、PAGE检测其分子量并观察CaM有无Ca~(2+)结合时的电泳行为,检测其紫外扫描光谱,同时用交联剂碳二亚胺制备CaM偶联抗原进行动物免疫,并用间接Elisa法检测动物血清免疫效价.[结果]纯化后的CaM对PDE有明显的激活作用,电泳结果显示为均一条带,分子量约为17.3 kDa,在SDS-PAGE中,CaM结合Ca~(2+)时比未结合Ca2+时迁移率快;而在PAGE中,迁移率在结合Ca~(2+)比未结合Ca~(2+)时慢;紫外光谱扫描显示约在251、260、267、272 和283 nm有5个吸收峰,动物血清免疫效价为1∶800.[结论]用phenyl-Sepharose层析法纯化CaM和用碳二亚胺法制备CaM偶联抗原是成功的.     

铜胁迫下紫鸭跖草特异性蛋白质性质研究(英文)

[目的]研究紫鸭跖草在铜胁迫下表达的特异性蛋白质,以期探明紫鸭跖草耐铜机理。[方法]以超积累铜植物紫鸭跖草(Setcreasea pur-purea Boom)为试验材料,通过水培、电泳和层析等方法,分析其表达的特异性蛋白质分子量、表达时间以及表达时铜的最低浓度,同时对该特异性蛋白质进行了分离纯化。[结果]铜胁迫下紫鸭跖草诱导表达特异性蛋白质的最低铜浓度为 50 μmol/L,表达的时间是第 4 周,其分子量为 89.4kDa。[结论]该研究结果表明紫鸭跖草耐铜特性与其表达的特异性蛋白质密切相关。     

猪骨蛋白酶解液美拉德反应产物的抗氧化活性研究

以猪骨蛋白酶解液和葡萄糖（或木糖）为原料,100 ℃水浴加热120 min以制备美拉德反应产物,采用超滤分离产物获得不同分子量范围（<1、1～5、5～10、>10 ku）的组分,研究各分离组分的体外抗氧化活性。结果表明,不同组分均具有一定的抗氧化活性,其中分子量>10 ku的组分具有较高的DPPH自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性,表明高分子量美拉德反应产物的抗氧化能力更强。葡萄糖、木糖组产物的自由基清除能力、还原能力以及Fe2+螯合活性差异均不显著（P＞005）,说明还原糖结构对该研究制备的美拉德反应产物的抗氧化活性未产生明显影响。     

微波复合酶水解植物蛋白制取小分子多肽的研究

[目的]为了研究微波复合酶水解植物蛋白制取小分子多肽的可行性。[方法]采用微波加热和中性、酸性蛋白酶双酶复合水解大豆分离蛋白(SPI),并用高效毛细管电泳和凝胶渗透色谱等分析方法进行了验证,讨论了反应机理,还对微波和常规加热进行了对比。[结果]采用微波加热和复合酶水解蛋白质可得到小分子多肽,其分子量在2 000~8 000 Da。SPI在微波复合酶水解条件下15 min即达到了常压酸解6 h的水解度,缩短了反应时间,提高了分解效率。[结论]微波加热和复合酶水解是将蛋白分解成多肽的高效方法。