侵染观赏百合病毒寄主范围研究

通过对5个观赏百合品种样品ELISA检测,发现甘肃省观赏百合主要受黄瓜花叶病毒(CMV-Li)和百合无症病毒(LSV)的侵染,并且两种病毒存在复合侵染现象.5品种中CMV-Li和LSV检出率分别为40%和80%,复合侵染率为40%.侵染观赏百合的病毒寄主范围较窄,CMV-Li不能侵染CMV的常规鉴别寄主普通烟、心叶烟和苋色藜,但可侵染黄瓜、曼陀罗、菜豆(美国),侵染后植株可产生明脉、花叶、皱缩等症状,接种发病的菜豆和黄瓜经ELISA检测,可以作为CMV-Li鉴别寄主以及CMV-Li和LSV分离寄主.     

百合无症病毒的RT-PCR检测

以百合病株为材料,针对百合无症病毒(LSV)的CP基因序列,设计合成了一对特异引物,并通过RT-PCR技术扩增出与预期大小相一致的870 bp片段,而对照无任何产物,应用该方法对田间百合中的LSV的带毒情况进行检测,检出率达80%,检测灵敏度高,专一性强,为百合的病毒检测提供了一种分子生物学检测方法.     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒提纯和抗血清制备

采用PEG沉淀并结合差速离心技术,获得了精提纯的侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV-Li).提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线.OD260 nm/OD280 nm=1.236.将提纯病毒免疫兔子制备得CMV-Li抗血清.经微量沉淀法和间接ELISA法测定,其效价分别为1∶1024、1∶4096.两种方法相比,间接ELISA具有灵敏度高、特异反应强等优点.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒西瓜、甜瓜种子的带毒率和传毒率

[目的]加强种子带毒检测,防止黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)通过种子传播而导致该病害的扩散和流行.[方法]以感染CGMMV的西瓜、甜瓜病株收获的种子为材料,应用DAS-ELISA检测感染CGMMV的种子带毒率和传毒率.[结果]250粒西瓜种子全部为阳性,带毒率达100%;623株西瓜幼苗14株为阳性,传毒率为2.25%.130粒甜瓜种子122粒为阳性,带毒率达93.85%;2 050株甜瓜幼苗58株为阳性,传毒率为2.83%.灵敏度检测种子带毒量在感染种子研磨样体积与健康种子研磨样体积为1/1 000时仍检测是阳性;叶片带毒量在病叶研磨样体积与健康叶研磨样体积为1/10 000时仍检测是阳性.[结论]感染CGMMV西瓜、甜瓜种子带毒率高而传毒率相对较低,说明CGMMV主要以种子表面带毒为主.灵敏度检测表明DAS-ELISA能进行大批量的种子检测.     

兰州百合病毒RT-PCR检测技术建立及应用

病毒病是引起兰州百合产量下降、品种退化的主要原因,准确、高效的病毒检测技术在百合脱毒种球生产和推广应用中十分重要。根据CMV、LSV和LMoV病毒外壳蛋白基因序列设计引物,以百合18S rRNA为内参照,建立兰州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR检测体系。对兰州百合主栽区病毒病的抽样调查发现,CMV、LSV带毒率分别达到98%、100%,LMoV检出率在不同时期样品中存在较大差异。     

东方百合离体再生前后叶片遗传稳定性的ISSR检测

以东方百合品种西伯利亚(Siberia)为材料,对影响百合ISSR-PCR的主要参数进行优化,确立了所适用的ISSR反应体系和扩增条件,并采用Mix体系进行引物筛选,得出最佳引物为:3A30、3A37、UBC815和UBC844。利用本试验优化的引物和Mix体系,对组织培养再生前后的百合叶片遗传物质的稳定性进行检测,结果表明,再生前后百合叶片遗传物质未发生明显变化,稳定性较高。因此,可以采用组培快繁的方法扩大东方百合原种的生产量。     

播种量与施钾量对兰州百合播种当年生长发育的影响

以兰州百合为试材,研究了播种量和施钾量对兰州百合播种当年生长发育的影响。结果表明,不同处理间兰州百合苗期、现蕾期的株高无显著差异,摘花期的株高存在显著差异(P 0.05);从植株株高的总增加量看,百合植株的生长受播种量与施钾量的影响较大。播种量和施钾量为适中水平(播种量156 000粒/hm~2、施钾量150 kg/hm~2)时对兰州百合植株的生长有促进作用,播种量和施钾量为高水平(播种量204 000粒/hm~2、施钾量225 kg/hm~2)时对兰州百合植株的生长有一定的抑制。不同处理间地上部鲜重、地上部干重、鳞茎鲜重和鳞茎干重存在一定差异。同一播种量下不同施钾量对兰州百合也有较大影响,在适中播种量(156 000粒/hm~2)与高施钾量水平(225 kg/hm~2)条件下,兰州百合植株整体的物质积累量最大,地上部鲜重、地上部干重、鳞茎鲜重、鳞茎干重分别为(4.76±0.38)、(2.29±0.33)、(23.63±2.85)、(6.49±0.63)g;随着播种量和施钾量的继续增加,兰州百合植株整体的物质积累量有所降低。     

陕西线辣椒种子携带和传播病毒研究初报

2004-12~2005-01,从陕西省线辣椒主产区随机采集3个线辣椒品种的28份种子样品,经酶联免疫吸附法(EL ISA)和RT-PCR法检测发现,28份种子样品中,与烟草花叶病毒(TM V)抗血清呈阳性反应者占14.29%,呈弱阳性或可疑反应者占42.86%;与黄瓜花叶病毒(CM V)抗血清呈阳性反应者占7.14%,呈弱阳性或可疑反应者占46.43%;仅有1份种子(占3.57%)与马铃薯Y病毒(PVY)抗血清出现弱阳性或可疑反应,其余均为阴性反应。线辣椒苗期生长观察试验表明,只有对TM V表现强阳性反应的3份种子样品,在出苗后40 d出现轻型花叶症状,其他对TM V,CM V和PVY表现弱阳性和阴性反应的样品均未出现可见症状,直至出苗后70 d依然如此,说明种子带毒量较低时不足以引起幼苗发病。RT-PCR检测结果表明,随机抽取的5份样品播种后,均未从其幼苗的叶片中扩增出蚕豆萎蔫病毒(BBW V)的CP基因,说明这5份种子样品的幼苗中均不存在BBW V。研究结果还表明,采自宝鸡地区的种子样品TM V带毒率和带毒量较高;采自咸阳和渭南地区的种子样品CM V带毒率较高,但带毒量较低;采自宝鸡地区凤翔县的3份样品3种病毒均未检出;不同品种种子带毒率无明显变化规律。     

香石竹环斑病毒多种PCR检测方法的建立与评价

以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus,CRSV)的5个分离物为研究对象,分别建立了快速检测香石竹环斑病毒的多种PCR方法。结果表明,这些方法的灵敏度都比DAS-ELISA的灵敏度高,其中SYBR Green RT-PCR的灵敏度最高,可检测CRSV RNA的最低量是6.4pg。免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)和普通RT-PCR最低可从400ng的带毒叶片中检出CRSV,而免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)最低灵敏度可从40ng的带毒叶片中检出CRSV,是普通RT-PCR的10倍。     

黄瓜花叶病毒在甜瓜种子中的带毒检测及脱毒方法研究

为明确甜瓜种子携带黄瓜花叶病毒(Cucumher mosaic virus,CMV)状况,以5个品种甜瓜种子为材料,采用实时荧光定量PCR技术检测甜瓜种子、胚芽中CMV带毒率和带毒量。结果表明,供试种子、种胚带毒率分别为80%～96.6%和5.0%～25.0%,带毒量分别为6.62×10~4～5.47×10~7拷贝/粒和3.78×10~4～1.00×10~6拷贝/粒;种苗传毒率为0～6.6%,不同品种之间存在差异。种子的带毒率高而传毒率低,表明CMV主要存在于甜瓜种子的种皮上。试验比较了5种处理方法对带CMV甜瓜种子的脱毒效果。干热(65℃)、湿热(100℃沸水)、温汤(55℃)、干热+湿热(65℃干热+100℃沸水)、干热+10%Na_3PO_4(65℃干热+10%Na_3PO_4)处理甜瓜种子,均能降低种子带毒量。干热、湿热、干热+湿热和干热+10%Na_3PO_4处理后种子脱毒率可达96%以上,显著优于温汤处理(P0.05),并能促进种子发芽。干热+10%Na_3PO_4处理甜瓜种子后的种苗中未检出病毒,对CMV的脱除效果最佳。     

延庆地区侵染百合的病毒检测与序列分析

利用DAS-ELISA和RT-PCR等检测方法,对北京市延庆地区疑似感染病毒的百合植株进行了检测,并将RT-PCR扩增到的产物进行克隆及序列分析验证。DAS-ELISA结果表明：百合叶片的粗汁液与TuBV的抗体呈现阳性,初步确定北京市延庆地区百合感染郁金香杂色病毒（TuBV）。RT-PCR检测结合克隆测序结果表明：郁金香碎色病毒CP基因的核苷酸序列与GenBank上已登录的（AB090385.1,AB078007.1和S44147.1）郁金香碎色病毒的核苷酸序列的同源性均为100%,与已登录的（qb｜AAB19407.1｜,dbj｜BAD02938.1｜和dbj｜BAB83899.1｜）氨基酸序列同源性均在95%以上,同源性较高,进一步证明北京市延庆地区百合感染有郁金香杂色病毒（TuBV）。     

百合无症病毒的RT-PCR和IC-RT-PCR检测

 应用DAS-ELISA,RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测百合无症病毒（LSV）。 结果表明:RT-PCR和IC-RT-PCR分别可从2 ng和200 ng百合叶片组织中检测出LSV,分别是DAS-ELISA敏感度的1 000倍和10倍。百合鳞茎的不同取样部位对PCR检测结果的影响较大,RT-PCR难以从鳞片和根部检测出病毒,但IC-RT-PCR可以检测出病毒。     

贵州不同海拔地区马铃薯病毒病初步调查及检测鉴定

[目的]调查贵州省不同海拔地区马铃薯病害发生情况,鉴定出贵州省马铃薯易感病毒种类。[方法]采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(DAS-ELISA)对在黔南州、黔东南州及毕节地区采集的805份马铃薯样品进行病毒检测。[结果]805份马铃薯样品中检出有29份马铃薯X病毒(PVX)为阳性;41份马铃薯Y病毒(PVY)为阳性;285份马铃薯S病毒(PVS)为阳性;23份马铃薯卷叶病毒(PL-RV)为阳性,带病毒率46.95%。[结论]对贵州马铃薯危害较重的病毒种类依次为:马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)。     

引进种质西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

从日本引进的西瓜种子隔离种植后,采用生物学、双抗体夹心酶联方法及反转录PCR(RT-PCR)技术对其幼苗样品进行了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的检测,结果表明:生物学试验接种的黄瓜健康植株全部发病;双抗体夹心酶联试验结果均为阳性;RT-PCR反应后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果出现预期的715 bp特异性扩增产物。3种方法均表明此次从日本引进的西瓜种质已经受到黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染,须做销毁处理。试验结果表明,采用3种方法中的2种对样品进行检测,即可以根据检测结果确诊被检对象是否带有CGMMV病毒。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。     

侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒血清学检测方法研究

采用摩擦接种和PEG沉淀法对侵染观赏百合的黄瓜花叶病毒(CMV)进行了提纯,提纯病毒具有典型的核蛋白吸收峰曲线,D260 nm/D280 nm=1.236;利用提纯的CMV免疫大白兔制备抗血清,经微量沉淀法测定,其效价为1∶1024;用硫酸铵沉淀法提纯IgG,制备了辣根过氧化物酶标抗体,利用自制抗血清对DAS-ELISA、间接-ELISA和DIBA-ELISA检测侵染观赏百合的CMV灵敏度和检测范围进行了比较试验,结果表明DAS-ELISA检测的灵敏度较高,是间接-ELISA和DIBA-ELISA灵敏度的4倍;间接-ELISA和DIBA-ELISA的检测范围比DSA-ELISA宽.对21个观赏百合样品的CMV检测结果表明,DIBA-ELISA的检出率为66.67%,间接-ELISA的检出率为38.09%,二者的检出率分别比DAS-ELISA的检出率(23.81%)提高了42.86%和14.28%.     

3类观赏百合试管苗叶片结构及水分特性

1材料与方法 1．1材料试验于2004年6月-2006年6月在青海大学农牧学院农学系植物学及植物组织培养实验室进行。试材：东方百合品种为马克;亚洲百合品种为黄巨人;铁炮百合品种为白狐,取自青海大学农牧学院农学系组培室内培养而得的试管苗叶片。     

甘肃河西地区番茄病毒病病原种类鉴定

2006-2008年对甘肃河西地区番茄病毒病的种类进行了调查和鉴定.河西地区番茄病毒病田间表现为花叶和条斑等症状,种子可带毒.采用DAS-ELISA方法,从田间样本及该地区出入境番茄种子上检测到烟草花叶病毒(TMV)、番茄花叶病毒(ToMV)和黄瓜花叶病毒(CMV),并对TMV 和ToMV阳性样品进行了 IC-RT-PCR鉴定.该地区番茄病毒病优势病毒为烟草花叶病毒;13%的样本中检测出2种病毒的复合侵染.