家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因表达及其与茧层率的相关性研究

为研究家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)基因Spi1、Spi2与家蚕雌雄丝物质合成差异的关系,应用RT-PCR、实时定量PCR以及Western blot等方法,比较了6个家蚕品种幼虫丝腺中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因mRNA和蛋白水平的表达情况,并测定茧层率。结果显示,Spi1基因在家蚕幼虫5龄中后期开始表达,其中在中部丝腺(MSG)和后部丝腺(PSG)中的表达量都比较高,Spi1基因在雄蚕的丝腺及中肠中持续表达时间均比雌蚕长,Spi2在MSG以及头部和体壁有表达;Western blot检测显示,SPI1蛋白在雄性中从4龄眠期就有表达,而雌性只在5龄末期有表达;Spi1基因在雄性丝腺中表达和蛋白质翻译的持续时间均比雌性长;品种之间,菁松雌雄茧层率均较高,与分子水平上其幼虫丝腺中Spi1基因表达量较高、SPI1蛋白的表达显著高于其他品种相一致。表明家蚕丝物质合成效率与Spi基因在mRNA和蛋白水平上的表达量有关。     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

家蚕Notch信号通路基因的表达研究

[目的]研究家蚕Notch信号通路基因的表达情况。[方法]在实验室前期工作的基础上,用特异引物对家蚕的Notch信号通路上下游基因进行克隆,并对这些基因在家蚕5龄幼虫不同组织部位的表达进行研究。[结果]这些基因在各组织的表达量不同,其中fringe和groucho在家蚕头部表达量较多,在丝腺、精巢、卵巢中的表达量较少;notch在家蚕尾部表达量较少,在其他组织中表达量无明显差别。[结论]该研究为进一步研究家蚕Notch信号通路奠定了基础。     

家蚕神经肽促前胸腺激素基因mRNA的发育表达

[目的]研究家蚕神经肽促前胸腺激素基因mRNA的发育表达。[方法]采用荧光定量PCR方法,研究家蚕5龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫4个阶段脑—咽下神经节复合体中PTTH基因的mRNA表达量变化。[结果]5龄幼虫PTTH基因mRNA表达量高于预蛹期、蛹期和成虫3个阶段;5龄第6天PTTH基因mRNA表达量最高,蛹期4～8d时持续维持较高表达水平,化蛾前表达量又有所降低,成虫表达量最低。[结论]家蚕PTTH基因mRNA的发育表达变化可能与其调控蜕皮激素合成的功能有关。     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

黄白茧蚕的叶黄素及不同颜色蚕茧丝胶、丝素含量比较

为探索家蚕食用桑叶后叶黄素在体内的吸收和代谢变化规律,以茧色限性品种为材料,用紫外分光光度法检测了大蚕期蚕体血液和丝腺中的叶黄素含量.结果表明:结黄茧的雌蚕血淋巴和丝腺中的叶黄素含量比结白茧的雄蚕高;白茧蚕血淋巴中的叶黄素含量约4μg/mL,丝腺的叶黄素含量约为5μg/mL,4～5龄全期无明显变化;黄血蚕血淋巴中的叶黄素含量随生长发育而逐渐增多,在5龄的第3 d时最多(26.4μg/mL),丝腺中的叶黄素含量在5龄的第5 d时达到最大值,为228.4μg/g;不同颜色茧的丝胶含量顺序为黄茧＞绿茧＞白茧,脱胶率顺序为黄茧＞绿茧＞白茧.     

家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄幼虫组织中的表达谱分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在丝腺及其他组织中的表达情况,为探讨细胞周期蛋白家族基因在细胞周期中的作用提供参考。【方法】取家蚕5龄3d幼虫的脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢、卵巢及血液等组织,用Trizol提取各组织的总RNA并反转录合成cDNA。以Actin3为内参基因,合成的cDNA为模板,利用每个基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,检测细胞周期蛋白家族基因在转录水平上的表达情况。【结果】在丝腺中,CyclinE基因的表达量最高,CyclinA、CyclinL1基因表达较弱,而CyclinB、CyclinB3基因没有表达;在其他组织中,CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因均在精巢中高表达,而CyclinE基因在脂肪体中表达较高。【结论】CyclinE基因在家蚕丝腺细胞G1/S期起重要作用,CyclinB、CyclinB3基因在G2/M期起作用;CyclinA基因可能参与丝腺染色体的后期复制;CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因在家蚕精巢中的精母细胞发育形成精子进行分裂时起着重要作用。     

家蚕一种hAT家族转座酶基因的分析

[目的]对家蚕中一个潜在的hAT家族转座酶编码基因BmhAT进行分析.[方法]通过生物信息学方法,分析BmhAT转座酶的结构域及序列同源性.采用Real-time PCR方法,对BmhAT在野蚕及家蚕不同品种中的拷贝数进行分析以及在mRNA水平上测定BmhAT在家蚕不同组织中的相对表达量.[结果]BmhAT与许多hAT家族转座酶在序列上有很高的同源性,并具有hAT家族转座酶的保守结构域;BmhAT在家蚕基因组中存在约3-6个拷贝;在家蚕后部丝腺和脂肪体中的表达量分别是参照基因actin 3的0.4倍和0.6倍.[结论]BmhAT可能是家蚕中一个有活性的转座酶基因,编码家蚕一种新的hAT家族转座酶.     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^-1 IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构; Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^-1。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

溴虫腈对家蚕起蚕不同性别的毒力比较

[目的]了解吡咯类杀虫剂溴虫腈对家蚕不同性别的毒力差异。[方法]以家蚕卵色限性品种卵2为供试材料,采用浸叶法测定溴虫腈对家蚕雌、雄2～5龄起蚕的半致死浓度(LC50)。[结果]溴虫腈对该品种雄蚕各龄期起蚕的LC50都高于同一龄期的雌起蚕,不同龄期中溴虫腈对3龄雌起蚕和雄起蚕的毒力最大,然后依次为2、4、5龄雌起蚕和雄起蚕。[结论]家蚕起蚕雌雄性别对溴虫腈的耐受性存在明显差异,该研究结果为进一步研究家蚕对溴虫腈的耐受性机理奠定了基础,也为指导蚕桑安全生产、专养雄蚕和防治鳞翅目害虫提供了参考。     

不同饲育回数对洞庭和碧波原蚕综合性状的影响

［目的］研究洞庭、碧波原蚕在贵州地理环境和气候条件下的性状表现。［方法］将洞庭、碧波原种催青收蚁后,以一日四回育为对照,设二回育和三回育2个试验区,各3次重复,小区蚁量1 g,于2009年春季开展全龄不同饲育回数的试验研究。［结果］全龄不同饲育回数对洞庭、碧波原蚕的发育经过没有明显影响,但对碧波原蚕的幼虫生命力和发育整齐度影响较大。其中,发育整齐度和眠起情况均以二回育区最不整齐,小蚕发生率为2.43%,分别是三回育和四回育的2.25、2.93倍;4～5龄期发病率和蔟中死蚕率均为0.50%,分别比三回育和四回育各高出0.32、0.17和0.32、0.17个百分点。洞庭品种4龄结茧率各处理间差异不显著,碧波品种4龄结茧率三回育和四回育与二回育之间均存在显著差异;洞庭、碧波品种对4龄健蛹率各处理间差异不显著;洞庭品种单蛾产卵量和单蛾良卵数四回育和三回育与二回育之间均存在显著以上差异,碧波品种各处理间产卵成绩差异不显著;洞庭、碧波品种单蛾不受精卵数和单蛾死卵数各处理间差异不显著。［结论］在贵州春季气候环境和桑叶基础条件下,洞庭、碧波原蚕采用全龄一日三回育完全可行,二回育不宜采用。     

家蚕免疫负调控分子BmFAF的功能

【目的】在细胞和个体水平上探讨家蚕BmFAF的免疫负调控功能,为研究昆虫免疫稳态提供参考。【方法】通过RT-PCR技术克隆BmFAF并进行结构域预测和分析;利用荧光定量PCR检测BmFAF在家蚕各龄期以及5龄第3天幼虫的各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征;构建BmFAF的细胞表达载体以及合成用于RNAi的dsRNA,通过质粒或dsRNA的转染在BmE细胞中过表达BmFAF或降低BmFAF的表达水平,并利用Western blotting或定量PCR予以确认,同时检测抗菌肽基因表达水平的变化;通过注射dsRNA在个体中降低BmFAF的表达水平,并检测BmFAF对抗菌肽基因表达水平和家蚕感染细菌后存活率的影响。【结果】BmFAF与其他物种FAF家族成员有较高的同源性,与人类HsUBXD8、HsFAF1和果蝇DmCaspar分别具有60%、42%和47%的相似性,并具有保守的UBX结构域。时空表达特征分析表明,除生殖腺外,BmFAF在免疫组织中表达量略高于其他组织,眠蚕期表达量显著高于起蚕期,尤其在2龄和3龄眠蚕中的表达量最高;5龄时BmFAF的表达量普遍较低,而从5龄发育至预蛹期时,BmFAF的表达水平有所上升。免疫诱导表达谱显示,家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或黏质沙雷氏菌0.5 h后,脂肪体中BmFAF的表达水平即显著下降,且在12 h内没有恢复,而抗菌肽BmCecropinA1的表达则持续上升,并在12 h时达到最高。在BmE细胞中过表达BmFAF,抗菌肽BmCecropinA1、BmAttacin和BmMoricin的表达水平与转染对照质粒的细胞中的抗菌肽相比,均显著降低。在细胞中转染dsRNA后,BmFAF的表达水平被有效地降低50%-60%,抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin的表达水平与对照相比均显著升高。对5龄第2天家蚕幼虫注射dsRNA,24 h后通过荧光定量PCR检测到BmFAF的表达水平在注射dsFAF的家蚕中下降至注射dsEGFP对照中的45%;而抗菌肽BmCecropinA1和BmMoricin、BmAttacin的表达水平均被显著上调。这些家蚕通过注射感染黏质沙雷氏菌24 h后,死亡率即低于对照组,在感染72 h后仍有40%左右的家蚕存活,而对照组中则无家蚕存活。【结论】结构分析、表达特征以及细胞和个体水平上的功能研究表明,BmFAF是一个具有免疫负调控作用的分子,通过抑制抗菌肽的表达维持家蚕免疫稳态, 而降低BmFAF的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高,从而有助于减缓甚至避免家蚕在感染细菌后的死亡。     

多丝量家蚕品种9601×92的育成及推广

[目的]研究多丝量家蚕品种9601×92的选育及其性状表现。[方法]在家蚕中导入野桑蚕的基因,育成了一对春用品种"9601×92",对其主要经济性状和推广情况进行研究。[结果]与对照种菁松×皓月相比,该品种万头收茧量提高7.49%;万头茧层量提高10.72%;万头产丝量提高8.50%;50 kg桑产茧增加4.18%;5龄蚕50 kg桑产丝量提高4.81%。经多点试养,该品种主要经济性状稳定,丝质优良,尤其是净度好,生产试养中其张种比菁松×皓月增产4.8 kg,茧层率提高1个百分点,张种增值80多元。[结论]该品种具有高产、优质、体健、好养、易繁的特点,综合经济性状优良,适应性强,可在山东省及北方蚕区等适宜地区饲养,是一对春、秋兼用的优质高产家蚕新品种。     

反义寡核苷酸干涉家蚕非编码RNA的研究

[目的]研究反义寡核苷酸干涉家蚕非编码RNA表达的情况。[方法]构建Bm-15的反义寡核苷酸探针,通过脂质体转染昆虫Sf9细胞干涉Bm-15的表达。[结果]转染后细胞中Bm-15的表达量下降了63%,差异达显著水平,表明反义寡核苷酸探针对Bm-15基因表达有较好的抑制作用。[结论]该研究为进一步研究非编码RNA的功能奠定了良好的基础。     

家蚕抗逆性与若干品种性状的因子分析

[目的]了解家蚕品种性状与抗逆性的关系。[方法]应用因子分析方法对15个家蚕品种的3个抗逆性状及若干品种性状进行分析。[结果]所分析的这些性状可以综合为4个主因子性状群:抗逆性状因子、经济性状因子、茧质性状因子和生长发育因子;通过提高家蚕品种的虫蛹率,可以增强家蚕的耐氟性和耐高温多湿性,但不利于改良家蚕的耐吃湿叶性,对家蚕幼虫生命率、全茧量和茧层量的提高只能协调改良。[结论]由于因子间具有独立性,可依据该群体因子的相对重要性,采取有重点的逐步改良方法,以提高育种效率。     

3种微生物诱导的家蚕attacin基因异常表达形式的研究

[目的]研究家蚕抗菌肽attacin基因在不同诱导源诱导时的表达情况。[方法]应用3种外源微生物BmNPV、JM109以及农杆菌LBA4404对家蚕进行诱导,半定量PCR检测attacin基因在诱导后的家蚕血液和脂肪体的表达情况,对诱导表达产物进行克隆测序及进一步的分析。[结果]attacin基因在所有诱导后的脂肪体中均出现1条800 bp左右的特异表达条带,克隆测序（GenBank登录号：FJ373020）后发现其产生由正常表达形式的2个内含子未被剪接引起,且原序列第1内含子5′端的1个TGA终止密码子使得加长的特异表达序列翻译氨基酸时在此处终止,最终导致了attacin C末端结构的缺失。[结论]attacin基因有2种剪接形式,该研究对探明atta-cin基因在家蚕免疫中的作用具有参考价值。