利用实时荧光定量PCR和数字PCR检测鉴定水稻细菌性条斑病菌

白叶枯病和条斑病是水稻重要的细菌性病害。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)和水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)属于同种下的2个致病变种。鉴别Xoo和Xoc对检疫和防控这2种病害至关重要。Xoo和Xoc中的铁-红酵母酸/铁-粪生素受体基因fhuE在进化过程中因不同程度地缺失而成为假基因。针对Xoc中有而Xoo中缺失的fhuE部分序列设计引物，筛选出Xoc特异引物XocFhuE-F(5’-ATCGAACGATGTCACCAGGG-3’)和XocFhuE-R(5’-AGAAACGTGCGGCCAGATAA-3’)。用XocFhuE-F/XocFhuE-R能只从Xoc菌株中仅扩增出159 bp片段，并结合荧光染料建立了SYBR Green实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和EvaGreen微滴数字PCR(digital PCR,dPCR)方法来检测鉴定Xoc。在20μL反应体系中加1μL模板，qPCR检测菌悬液中Xoc的下限是1.6×10<...     

一株拮抗水稻条斑病菌的蜡样芽孢杆菌的分离和鉴定

水稻条斑病菌(Xanthomolias oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染水稻,引起细菌性条斑病(bacterial leaf streak,简称BLS),严重威胁水稻的安全生产。为筛选防治BLS的生防细菌,以Xoc的模式菌株RS105为靶标菌,采用平板稀释和抑菌圈法,从大白菜根际土壤中分离筛选到具有拮抗活性的细菌菌株512。通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB序列分析,鉴定菌株512为蜡样芽孢杆菌,命名为Bacillus cereus 512。抑菌试验显示,B.cereus 512对黄单胞菌属不同种细菌的拮抗活性存在较大差异,其中对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)的拮抗效果最强。发酵液的稳定性试验表明,抑菌活性物质对高温和蛋白酶不敏感,耐强碱不耐强酸。在原丰早水稻品种上,针对水稻条斑病防治的初步试验结果显示,B.cereus 512对Xoc在水稻叶片上引起的水渍症状的扩展具有明显的抑制作用。综上所述,B.cereus 512能够拮抗Xoc和Xoo,在BLS的生物防治中将具有较大的应用潜力。     

江苏省稻曲病菌的群体遗传结构

为了分析来源于江苏省徐州市、苏州市、南京市、盐城市和南通市的48个稻区稻曲病菌[Ustilaginoideavirens(Cook.)Tak.]的群体遗传多样性,通过Rep-PCR技术,用3对特异性引物BOX、REP和ERIC对48个菌株基因组DNA进行了PCR扩增,以彼此间的带位相似率达90%为界,BOX扩增的谱型被分为4簇,REP的谱型被分为4簇,ERIC的谱型被分为5簇。48个稻曲病菌株接种于感病品种两优培九上,被划分为3个致病力类型,其中弱致病性类型占50%,为优势致病性类型。由于参试菌株遗传多样性值最大(0.55),簇群分类与地理位置显著相关,所以BOX引物较其他两种引物更适合进行稻曲病菌的群体遗传多样性分析。群体遗传多样性值BOX为0.55,REP为0.44,ERIC为0.42,说明江苏省这5个地区稻曲病菌群体的遗传分化不明显,遗传多样性稳定。江苏省5大稻区48个稻曲病菌的BOX、REP、ERIC簇群分类与地理位置、致病性类型均无显著的相关性。     

水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析

根据黄单胞菌hisF基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中克隆了hisF同源基因,命名为hisFXoo.NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,HisFXoo属于组氨酸生物合成蛋白家族的一员,具有与其他HisF蛋白相似的结构.序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的.同源性搜索比较显示,与水稻条斑病菌(Xoryzae pv.oryzicola,Xooc)的hisF(登录号:DQ372107)同源性高达98%.通过同源重组的方法,构建了hisFXoo的插入突变体,在NA+Amp平板上筛选后,并且经过PCR及Southern杂交验证插入正确.在MMX基本培养基中生长测定发现,hisF突变体生长能力明显下降,证明hisF基因与Xoo生长代谢相关.但是,该突变体仍具有致病性,并且毒力与野生型菌株没有明显差异.     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。     

云南滇西高原粳稻区白叶枯病菌遗传多样性初探

用IS-PCR和rep-PCR法分析了17个采自云南滇西高原粳稻区的水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.O-ryzae)和7个其他地区的水稻白叶枯病菌的群体遗传多样性。用2个适合中国水稻白叶枯病菌的引物J3和ERIC对这24个菌系基因组DNA进行PCR扩增反应,J3引物有14条条带,ERIC引物有13条条带,2个引物呈现18种谱型。用PHYLIPVersion3.6软件UPGMA聚类分析法分析白叶枯病菌系之间的遗传距离,可将24个病原菌分为4簇,3个来自菲律宾的白叶枯病菌与中国的菌系距离较远,云南高原粳稻区分离的菌系十分复杂,4个簇中都有,但主要集中在2个簇中,共有14个菌系。     

广东和江西省柑橘溃疡病菌的遗传多样性分析

【目的】明确来自广东和江西两省柑橘溃疡病菌菌株之间的分子水平差异.【方法】使用ERIC引物,通过REP-PCR技术,对来自我国广东和江西省12个市(县)12个柑橘品种的71个柑橘溃疡病菌株进行遗传多样性研究.根据DNA指纹特征,并用NTSYS软件聚类分析.【结果和结论】71个菌株在相似值为0.64时,可以分为A、B两簇,其中来自江西赣州6个市县的所有溃疡病菌株全部聚在A簇,而来自广东有50%的菌株聚在B簇.取相似值为0.88时,A、B簇又各自分为6个遗传组.广东和江西两省柑橘溃疡病菌存在明显的遗传多样性,不同地理来源和不同柑橘品种之间的溃疡病细菌多样性差异明显.     

水稻条斑病菌xopQ1_(Xoc)在病程中功能的初步研究

【目的】基因组学揭示,水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)中存在与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv. tomato,Pst)中通过Ⅲ型分泌系统分泌的HopQ1-1同源的XopQ1Xoc,但其是否为T3S效应分子以及在病菌致病性中的功能并不清楚。【方法】通过基因敲除技术,获得了水稻条斑病菌xopQ1Xoc的突变体。【结果】致病性测定结果发现,xopQ1Xoc突变后,病菌在水稻上的毒性增强,细菌生长能力增强。非常有意义的是,xopQ1Xoc突变体菌液浓度为3×108CFU/mL时仍能在烟草上激发过敏反应,但在浓度为104CFU/mL时,8d后可在烟草上产生坏死症状。功能互补结果显示,xopQ1Xoc能够恢复突变体在水稻上的毒性至野生型水平和在烟草上丧失产生坏死病斑的能力。Western杂交结果显示,XopQ1Xoc不能通过T3S装置进行分泌。【结论】XopQ1Xoc是水稻条斑病菌T3S效应分子,可能作用于植物的免疫系统,有利于病害的发展。为进一步揭示水稻-黄单胞菌互作的分子机理提供了科学线索。     

水稻白叶枯病致病性基因研究进展

稻黄单胞菌水稻致病变种[Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)]可引起水稻白叶枯病,是水稻病害中最严重的病害之一,其与水稻互作是基因对基因的关系。Xoo基因组测序的完成极大推动了对Xoo基因功能的研究。为此,该文对近几年来Xoo致病性基因的鉴定情况进行统计,并就致病性基因的突变菌株对水稻接种情况和菌株自身变化进行了归纳,较为详细阐述了当前对Xoo无毒基因的鉴定研究状况,为水稻抗白叶枯病育种以及研究致病基因和致病机制提供理论基础。     

水稻黄单胞细菌的无毒基因

水稻黄单胞细菌白叶枯致病变种与水稻品种的互作关系符合基因一基因假说。病菌无毒基因(A)与寄主抗病基因(R)显性互作表现抗性反应。许多黄单胞细菌的无毒基因属于avrBs3／pth家族。已报道的avrxa5、avrXa7、avrXa10以及本实验室从水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ克隆的avrXa3均属于avrBs3／pth家族。最近的研究还发现，PR6菌株中有2个硫同化基因簇成员raxP和raxQ对决定avrXa21活性是必需的。笔在研究无毒基因avrXa3时，从JXOⅢ的基因组库克隆中发现一个与甘蓝黑腐黄单胞菌烯醇化酶一磷酸酶基因的同源序列也具有无毒基因活性。在介绍黄单胞细菌无毒基因类群和avrBs3／pth家族基因结构与功能的同时，结合本实验室的研究结果着重对水稻白叶枯病菌无毒基因的研究进展进行综述。     

水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因的敲除

wxocA、wxocB、wxocD、wxocE和wzt是水稻条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzicola，Xooc）的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）合成基因，avrXa3是水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv．oryzae，Xoo）的一个无毒基因。利用pBCSK（-）和pKNG101两个质粒的复制起点不被水稻黄单胞菌识别的特点，把wxocA、wxoeD、wxocE和wzt的中心区域克隆在pBCSK（-）上，获得突变转化单元pBCSK：：ΔwxocA、pBCSK：：hwxocD、pBCSK：：AwxocE和pBCSK：：Δwzt。把wxocB和avrXa3基因的旁侧序列和一个氯霉素抗性基因cm构建在pKNG101上，获得突变转化单元pKNG101：：ΔwxocB和pKNG101：：Δavr。以电转化方式把这些LPS合成基因突变转化单元DNA转入Xooc菌株RS105，把无毒基因突变转化单元转入Xoo菌株PXO99，通过同源重组分别获得了RS105中5个如相应基因突变体MwxocA、MwxocB、MwxocD、MwxocE、Mwzt和一个无毒基因的突变体PX099Δavr。SDS-PAGE分析发现，lps突变体的O抗原或核心寡糖的合成被破坏。致病性分析结果显示，基因wxocB、woxocE和wzt与致病性有关，前两基因的突变导致细菌完全失去毒性，而后一基因的突变导致细菌部分丧失毒性。与PX099相比无毒基因突变体PX099Δavr改变了原有的毒性表型，在IRBB50（Xa4／xa5）和Asominori（Xa17）上由较感转变为较抗表型。因此，本试验证明，以pBCSK（-）和pKNG101为载体敲除水稻条斑病菌和白叶枯病菌致病相关基因是可行的。     

水稻白叶枯病菌致病性分子遗传学基础

 水稻-白叶枯病原菌互作符合基因对基因关系，是研究禾本科植物-病原菌互作的理想模式系统。目前已鉴定和克隆出许多白叶枯病菌致病相关基因。其它革兰氏阴性植物病原细菌致病性分子遗传学和基因组学研究，为揭示水稻白叶枯病菌致病性分子机理提供了丰富的背景知识，其中以发掘TTSS效应分子的研究备受关注。本文将对白叶枯病菌致病性分子机理进行综述，以期为研究水稻-白叶枯病菌互作的功能基因组学提供科学线索。     

水稻白叶枯病菌对拌种灵抗药性分子机制研究

  通过紫外诱变获得了抗拌种灵水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的突变体，这些突变体可以在含100 μg·ml-1拌种灵平板上生长，而敏感菌株在10 μg·ml-1浓度下则不能生长。敏感菌株琥珀酸脱氢酶活性受拌种灵强烈抑制，而抗药突变体的酶活性较低，且不受药剂抑制。应用6对引物，从水稻白叶枯病菌野生敏感菌株和室内诱导抗药性菌株中扩增到琥珀酸脱氢酶基因全序列。该基因全长3 616 bp，编码1 115个氨基酸，含有2个内含子。与柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）琥珀酸脱氢酶核苷酸同源性93%，氨基酸同源性97%；与其它6种病原细菌琥珀酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列同源性为43%～95%。敏感菌株和抗药菌株的琥珀酸脱氢酶序列分析表明，琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基中229位氨基酸由组氨酸（CAC）突变为酪氨酸（TAC）是导致X. oryzae对拌种灵产生抗药性的主要原因。     

广西水稻白叶枯病菌致病型的初步鉴定

【目的】明确广西水稻白叶枯病菌致病型的分布和分化,为生产上该病害的综合防控提供理论依据。【方法】采用水稻白叶枯病菌中国鉴别寄主（金刚30、特特普、南粳15、爪哇14、IR26）对2013年从广西南宁、东兴、防城港、钦州、岑溪等地水稻病区分离得到的29株水稻白叶枯病菌进行致病型初步鉴定,同时采用部分近等基因系对5株南宁分离菌株致病性进行进一步分析。【结果】29株菌株在5个鉴别寄主上均出现感病反应,均为SSSSS模式,为强致病菌;5株南宁分离菌株能使目前抗谱最广的水稻材料CBB23感病。【结论】广西水稻白叶枯病菌致病力出现极大分化,需加强对该病害的防控及水稻抗病材料的筛选利用工作。     

云南水稻白叶枯菌的RAPD分析

选取云南水稻白叶枯病菌优势小种的代表菌株41个,利用从258个RAPD随机引物中筛选出多态性好的24条引物对其DNA进行多态性分析.指纹图谱和聚类分析结果表明,各优势小种间遗传差异较大,菌株间具有明显的遗传多态性,在不同的相似水平下可分为不同的遗传组群.水稻白叶枯病菌优势小种间在分子水平上存在明显差异,且遗传组群与小种间有对应关系,遗传距离为0.2时可以将41个水稻白叶枯代表菌株分为10个遗传相似组,其中第2、8、10组为主要组群,第2组包括14个菌株,主要为7号小种;第8组有9个菌株,全部为8号小种.     

水稻白叶枯病菌基因组简单重复序列分析

［目的］分析水稻白叶枯病菌基因组中的串联简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）,为其在白叶枯病菌基因组分析和遗传多样性研究提供标记信息。［方法］利用开放的基因组数据库资源,对已完成测序的3个白叶枯病菌菌株KACC10331、MAFF311018和PXO99^A进行系统的比较分析,包括基因组中SSR的结构类型、分布、丰度等;并以实例解读了在应用中可能遇到的问题。［结果］在这3个白叶枯病菌菌株的基因组中,由1～6个核苷酸为基序的SSR序列分别有940、926和1 035个;平均每隔5.26、5.34和5.06 kb的距离就有1个大于15 bp的SSR序列。在1～6个核苷酸为基序的SSR序列中,数量最多的是6碱基重复,其次分别是3、5、4、2碱基重复序列,而单碱基重复数目极少。在这3个菌株的基因组中,种类丰富、变异性高的是4、5、6个核苷酸的重复基序,但等位序列上3种菌株间的基序可能不同。［结论］3种白叶枯病菌菌株的SSR在结构类型和分布规律上均具有一定的相似性。     

插入序列在水稻白叶枯病菌防治上的研究进展

概述了水稻白叶枯病与插入序列(Insertion sequence,简称IS)的定义及相互联系.插入序列的研究在防治水稻白叶枯病上有重要意义,并可应用于各种致病型的水稻白叶枯菌的鉴定等.     

水稻白叶枯病菌fkbM基因对其运动性的影响

[目的]研究水稻白叶枯病菌fkb M基因对其运动性的影响。[方法]采用同源置换方法对水稻白叶枯病菌野生型菌株PXO99A的fkbM基因进行基因敲除,构建突变菌株ΔfkbM_(Xoo),同时构建互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)。通过运动性试验,确定fkbM基因对运动性的影响。[结果]与野生型菌株PXO99~A相比,ΔfkbM_(Xoo)突变体运动性明显减弱,而互补菌株ΔfkbM_(Xoo)(C)能基本恢复水稻白叶枯病菌的运动性。[结论]水稻白叶枯病菌fkbM基因突变能减弱水稻白叶枯病菌的运动能力。