噬菌体phiC31位点重组酶系统在植物转基因中的应用

来源于链霉菌属噬茵体（streptomyces phage）的phiC31定点重组酶系统可诱导重组位点attB（细菌基因组）和attP（噬菌体）之间DNA序列的重组,该重组酶是继Cre／lox重组酶系统和FLP／frt重组酶系统之后的又一种新型位点重组酶系统,在原核和真核生物基因整合、删除和倒位等方面得到广泛应用。文中主要对phiC31重组酶系统的来源、结构特性以及在植物转基因中的应用研究进展进行综述,为phiC31定点重组酶的进一步开发利用提供依据。     

植物转基因的整合特性及遗传分析

对转基因植物的外源基因整合到受体染色体上的整合机制,整合随机性与非随进性,整合位点及拷贝数等特性进行了综述.并对3种外源基因遗传规律的方式进行了分析,它们分别是:单基因位点(single-site)的孟德尔遗传方式、多基因位点(multi-site)的孟德尔遗传方式和非孟德尔(non-Mendel)的遗传方式.     

piggyBac转座子在绒山羊基因组中的整合位点及其特征分析

【目的】构建piggyBac（PB）转座子表达载体系统,研究PB转座子在绒山羊基因组中的整合位点。【方法】构建pB-CMV-EGFP-Neo转座载体和pcDNA-Trans辅助载体,利用lipofectamine 2000介导共转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得稳定转染的转基因细胞系。提取转基因细胞基因组DNA,利用反向PCR检测piggyBac转座子整合位点。【结果】构建了转座系统并成功介导外源基因在绒山羊成纤维细胞染色体中整合,获得了转基因细胞系;反向PCR检测显示在绒山羊基因组中有21个PB转座子整合位点;整合位点TTAA毗邻一侧的5个碱基组成中,PB转座子3′倾向于插入到富含AT（58.35%）碱基的区域,PB转座子5′倾向于插入到富含GC（57.8%）。【结论】PB转座子可在绒山羊基因组中发生高效转座,获得的整合位点信息可为利用PB转座子开展绒山羊研究提供理论参考。     

转基因油菜W-4T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测(英文)

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含AT区。序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RB border在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1%。可对W-4的转基因事件进行特异性检测。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为研究

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种,采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行为进行了研究.连续三代的研究结果表明Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株(T01,T02,T03,T05,T06,T07,T08)的基因组中,并稳定地遗传给后代.纯合转基因株系杂交分析表明,在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的,T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白基因整合位点是同源染色体的不同座位,而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白基因整合位点是在非同源染色体上.     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

多位点基因打靶的定点整合效率研究

利用PCR方法从pEGFP-N1中扩增pCMV-EGFP,从人基因组rDNA基因家族靶基因插入位点两侧分别扩增两条基因打靶同源重组引导序列DS1和DS2,将DS1、DS2片段插入pMD19-pCMV-EGFP中,构建成多位点基因打靶载体pMD19-DS2-pCMV-EGFP-DS1.通过脂质体将其转染至HEK293细胞内.通过荧光检测和PCR、测序等方法,检测和评价定点整合效率.试验结果表明,外源基因EGFP在转染细胞中持续稳定表达,EGFP定点整合率约为4%,不经药物筛选大大提高了整合效率,比传统的基因打靶技术提高了4000多倍,为转基因动物研究建立了高效的定点转基因技术.     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。本研究应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)技术扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含A/T区。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计的2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485 bp和405 bp预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达到0.1%。表明应用该技术可对W-4转基因事件进行特异性检测。     

转基因家畜的新品系培育

分析了利用现有的转基因技术所获得的G0代转基因家畜外源基因的整合和表达状况:在随机整合的情况下,存在大量嵌合体现象,不同的整合位点其表达效应不同;应用基因打靶技术实现定位整合,情况相对简单。在此基础上,提出不同整合类型对G0代转基因家畜进行遴选的方法和程序,以及建立转基因家畜纯合体的两条技术路线:一是利用遴选出的具有遗传稳定性的G0代个体,通过常规繁育获得;二是利用基因打靶技术,获得双等位基因整合(或敲除)的家畜。最后根据家畜育种的理论,提出了建立转基因新品系、进而形成新品种的步骤。     

转基因抗草甘膦棉花R1-3株系的分子特征鉴定

【目的】通过转化抗草甘膦除草剂基因G10aroA获得抗草甘膦除草剂的棉花转基因株系，对其进行分子特征鉴定分析，为今后棉花育种利用该株系提供必要的分子依据。【方法】利用农杆菌介导法，在草甘膦筛选条件下，通过组织培养获得棉花再生株系，利用Western blot对转基因棉花株系不同组织的外源蛋白表达进行检测；通过Southern blot确定株系中外源G10aroA整合位点的拷贝数；利用TAIL-PCR扩增外源基因整合位点侧翼序列，并通过NCBI BLAST工具比较分析其定位的染色体位置。【结果】通过草甘膦筛选，利用组织培养获得R1-3棉花再生株系；Western blot结果表明，外源基因在叶、苞叶、花、茎中均可正常表达，其蛋白大小约为46 kDa，与预期目标条带一致；基因组DNA酶切后杂交结果显示，R1-3株系外源序列的整合位点为单拷贝插入，其中，KpnⅠ酶切的杂交条带位于约6 557 bp处，Eco RⅠ酶切的2条杂交带位于略大于4 316 bp处；侧翼序列比对结果显示，外源序列融合到陆地棉A或D基因组的第11号染色体上，且在交换插入的过程中，左右边界的融合位点分别位于该染色体47 ...     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

转抗草甘膦基因烟草T-DNA侧翼序列的扩增与分析

[目的]研究抗草甘磷基因在烟草中的插入位点、T—DNA结构等整合情况。[方法]利用现有的3个转抗草甘膦基因的烟草材料,通过PCR Walking的方法扩增出携带抗草甘膦基因的T-DNA侧翼序列,并用DNAMAN、BLAST等生物信息学方法进行分析。[结果]对获得的PCR条带进行分析,结果表明这些侧翼序列均含载体骨架序列且结构各不相同。T-DNA和载体骨架序列都存在重组现象。[结论]研究在转基因植株中检测到了载体的骨架结构,说明转基因的同时有可能会造成非目的基因的转移,即转基因植物存在一定的风险,应对转基因植物转化载体和基因工程技术路线进一步改良。     

E-coli整合酶检测方法研究

通过检测整合酶确定多重耐药大肠杆菌是否含有整合子。试验采用梯度PCR方法确定扩增整合酶最佳温度,以该温度扩增247株菌整合酶,并对PCR产物鉴定测序,确定整合酶类型。结果表明,247株菌中有158株菌扩增出了Ⅰ型整合酶,13株菌扩增出了Ⅱ型整合酶,总共有171株菌扩增出了整合酶基因。表明可通过PCR扩增整合酶的方法监测多重耐药大肠杆菌携带整合子的情况。     

Cre／loxp位点特异性重组系统在转基因植物中的应用

位点特异性重组系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入或删除,已成为植物遗传操作中的重要工具。本文简要介绍目前应用最为广泛的Cre/loxp位点特异性重组系统的重组机制,并着重阐述Cre/loxp系统在删除转基因植物中标记基因及定点整合等方面的应用。     

秦川牛TNFSF11基因多态性及与体尺性状的相关性

为研究秦川牛TNFSF11基因多态性及其与秦川牛体尺性状的相关性,以399头同等饲养条件下的18～24月龄健康秦川母牛为研究对象,采用PCR-RFLP技术结合DNA测序技术检测TNFSF11基因的SNPs位点,并将其与秦川牛体尺性状进行关联分析。结果表明,DNA测序发现在TNFSF11基因第3内含子即34 080bp处(C331区域)和第3内含子34 096bp处(C332区域)分别发生C→T突变和T→C突变;PCR-RFLP分析发现,秦川牛TNFSF11基因C331区域经创造酶切位点后可以被限制性内切酶HincⅡ特异切割为有GG、GH和HH 3种基因型,C332区域可以被内切酶BseLⅠ特异切割为MM、MN和NN 3种基因型;与测序结果比对显示,秦川牛TNFSF11基因C331、C332各酶切基因型与测序结果显示相一致。卡方检验显示,C331位点在所检测牛群中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),而C332位点则处于Hardy-Weinberg极度不平衡状态(P0.01);且C331处GH基因型为优势基因型,G等位基因为优势等位基因,处于中度多态状态;C332处基因型MM为优势基因型,M等位基因为优势基因,处于中度多态状态;关联分析表明,C331位点不同基因型个体间在腰高、腰角宽和胸围方面差异显著(P0.05),C332位点在体斜长和腰高方面差异显著(P0.05)。经连锁不平衡检测发现,两位点存在一定的连锁特性(r2=0.213),将两突变位点进行单倍型分析可知,HHMM基因型各性状均显著高于其他基因型组合,且多标记位点的组合效应值高于单标记位点。说明TNFSF11基因对秦川牛体尺性状有显著的影响,可以作为秦川肉牛新品系培育早期选择的候选基因,其中组合HHMM可能是影响秦川牛体尺胴体性状的最佳基因型组合,在选育中应加大其选择力度。     

镰刀菌 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解酶系的结构

为探究植物细胞壁降解酶高效降解细胞壁的机制,用 RT-PCR 方法对 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解酶基因片段进行克隆,使用 Prot-Param、SOPMA、ProtScale Server 等软件对质谱鉴定结果进行生物学分析。结果表明：将 Q7-31T 菌株植物细胞壁降解相关酶归为 GH5家族内切葡聚糖酶、GH7家族内切葡聚糖酶、GH7家族外切葡聚糖酶和 GH10家族内切木聚糖酶4类酶。这些相关酶类为中等分子量大小,二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲4种元件构成,其中无规则卷曲的数量最高;均为亲水性酶,磷酸化位点比例较高,存在1～2个糖基化位点;均存在较高比例的催化结构域,三级结构呈中空的 C 字形。结论：少量的糖基化位点、高比例的催化结构域、多变的三维构象、大量的磷酸化位点与高效的协同作用方式可能决定 Q7-31T 菌株的植物细胞壁降解酶对细胞壁的高效降解。     

马铃薯抗晚疫病转基因材料的获得及活性氧清除酶系与抗病过程关系分析

 【目的】获得马铃薯抗晚疫病转基因材料,初步分析活性氧清除酶系与抗病过程的关系。【方法】通过农杆菌介导的方法,以茎段为外植体,将抗晚疫病基因R1、R3a 和RB分别转化马铃薯感病栽培品种Desiree,并通过特异PCR扩增目的基因、无菌苗快速抗病鉴定和离体叶片接种鉴定、RT-PCR分析来筛选阳性转化株系。并测定转基因株系和野生型接种晚疫病原菌生理小种89148-9后,体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性变化。【结果】结果证明,3个抗晚疫病基因都已经整合进入马铃薯基因组中并稳定表达,所获得的转基因株系接种小种89148-9后其抗性有不同程度的提高,大部分表现为高抗或抗病,有明显的HR反应;转基因株系在接种小种89148-9后3种酶的活性都升高,且活性高峰比野生型早。【结论】获得了一批高抗或抗晚疫病的马铃薯转基因材料;活性氧清除酶系可能参与了R基因介导的抗病过程。     

利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法，本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析，基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点，通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数，最后利用PCR扩增验证分析位点。结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb，Q20为96.1%，Q30为89.2%，能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361×2，平均测序深度为80×，reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀，测序的随机性比较好，可以进行后续分析；2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3 036，平均测序深度为140×，嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点，位于HG994969.1:2 704 213~2 705 255；3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×，T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85×，而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5′调控区序列的平均测序深度为154×，Actin基因的3′调控区序列的平均测序深度为164×，同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍，这表明T-DNA为单拷贝，与发现一个插入位点的结果相符合；4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点。转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台，也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点。     

优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文)

[目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。[方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。[结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。[结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。     

植物安全转基因技术研究现状与展望

转基因技术是进行基因功能研究和作物遗传改良的重要工具。根癌农杆菌介导转化法和基因枪轰击法是两种主要的遗传转化方法。从1996年首例转基因作物商业化种植以来,2012年全球有28个国家和地区种植转基因作物,种植面积已达1.7亿公顷。随着全球转基因作物的大面积商业化种植,转基因植物的安全性越来越多地受到公众关注。安全转基因技术的研发对于转基因植物的商业化生产具有重要意义。文章详细介绍了目前已报道的安全转基因技术原理及其应用现状。按其作用原理和目的将其分为4类：安全选择标记、标记基因删除及基因叠加、基因漂移防控法和基因定点编辑整合技术。其中,安全选择标记按其筛选原理分为糖代谢相关标记、氨基酸代谢相关标记、激素相关标记和抗逆相关标记。与抗生素和除草剂抗性标记相比,这类标记基因及其表达产物对人和其他生物更安全。标记基因删除及基因叠加技术包括共转化法、位点特异性重组法、转座子法、同源重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术,其中共转化法又包括农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的表达盒共转化法。基因叠加技术为复合性状转基因植物研发奠定了基础,有望成为未来多性状转基因植物研发的重要技术之一。基因漂流防控法包括叶绿体转化法和基因拆分法。基因定点编辑和整合技术包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统介导的基因定点编辑和整合技术。其中,TALEN和CRISPR/Cas9技术,设计简单,成本低,易操作,靶点分布广泛,有望成为安全转基因研发和应用的重要技术。文章对这些技术原理及其应用现状进行了综述,讨论了其优缺点,并展望了安全转基因技术研发重点和发展趋势。