小麦穗发芽抗性相关Vp1基因启动子的分离及功能验证

成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质。Vp1是调节胚发育, 促进胚成熟和休眠的重要转录因子, 对小麦种子休眠和穗发芽抗性具有重要作用。本研究分离了普通小麦B基因组Vp1基因的启动子, 生物信息学预测结果表明, 其含有9个脱落酸响应元件ABRE、2个DREB和6个MYB干旱响应元件、3个赤霉素响应元件GARE、1个水杨酸响应元件TCA-E、2个茉莉酸甲酯响应元件TGACG-motif、4个SKn-1和1个RYREPE胚乳特异表达元件。采用5′端缺失的方法, 构建了系列含Vp1启动子不同区段融合GUS报告基因的瞬时表达载体和植物表达载体。通过基因枪转化小麦愈伤组织, 瞬时表达结果显示, Vp1启动子在无诱导的情况下不能启动GUS基因表达, 在低温、ABA、GA、PEG和NaCl诱导后可以启动GUS基因表达, 表现诱导表达特性, 且其诱导表达强度随启动子缺失片段长度变短而减弱。利用Gateway方法成功构建了6个启动子各缺失片段类型的植物表达载体, 并通过农杆菌介导转化四倍体小麦Stewart, 获得转基因植株。该启动子可有效启动GUS基因在转基因植株的花药、糊粉层、穗轴及根中表达, 其他组织中没有表达。当启动子片段大于660 bp时, 外源ABA可诱导启动子启动GUS基因在转基因植株茎节中的表达。     

植物安全转基因技术研究现状与展望

转基因技术是进行基因功能研究和作物遗传改良的重要工具。根癌农杆菌介导转化法和基因枪轰击法是两种主要的遗传转化方法。从1996年首例转基因作物商业化种植以来,2012年全球有28个国家和地区种植转基因作物,种植面积已达1.7亿公顷。随着全球转基因作物的大面积商业化种植,转基因植物的安全性越来越多地受到公众关注。安全转基因技术的研发对于转基因植物的商业化生产具有重要意义。文章详细介绍了目前已报道的安全转基因技术原理及其应用现状。按其作用原理和目的将其分为4类:安全选择标记、标记基因删除及基因叠加、基因漂移防控法和基因定点编辑整合技术。其中,安全选择标记按其筛选原理分为糖代谢相关标记、氨基酸代谢相关标记、激素相关标记和抗逆相关标记。与抗生素和除草剂抗性标记相比,这类标记基因及其表达产物对人和其他生物更安全。标记基因删除及基因叠加技术包括共转化法、位点特异性重组法、转座子法、同源重组法以及基于位点特异性重组的基因叠加技术,其中共转化法又包括农杆菌介导的共转化法和基因枪介导的表达盒共转化法。基因叠加技术为复合性状转基因植物研发奠定了基础,有望成为未来多性状转基因植物研发的重要技术之一。基因漂流防控法包括叶绿体转化法和基因拆分法。基因定点编辑和整合技术包括锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统介导的基因定点编辑和整合技术。其中,TALEN和CRISPR/Cas9技术,设计简单,成本低,易操作,靶点分布广泛,有望成为安全转基因研发和应用的重要技术。文章对这些技术原理及其应用现状进行了综述,讨论了其优缺点,并展望了安全转基因技术研发重点和发展趋势。     

利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450

【目的】通过体外饲喂双链RNA（dsRNA）,利用RNAi技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450。【方法】采用PCR克隆获得麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450片段;利用双链RNA合成试剂盒合成麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA;在蚜虫人工饲料中,分别加入终浓度为0、3、5和7.5 ng•μL-1的dsRNA,每个试验组设置3个重复,分别于饲喂后2天、4天、6天、8天统计蚜虫的存活数;利用实时荧光定量PCR技术分析饲喂后目标基因的表达抑制情况。【结果】从麦长管蚜与桃蚜的cDNA中分别克隆细胞色素P450,所克隆片段同源性为90.1%,发现随着dsRNA浓度的增大,麦长管蚜和桃蚜的死亡率随着时间的推移不断升高,最高死亡率可分别达75.56%和64.44%。提取饲喂dsRNA浓度为7.5 ng•μL-1的不同时间段的蚜虫总RNA,实时荧光定量PCR结果表明,目的基因被沉默。【结论】利用麦长管蚜和桃蚜细胞色素P450保守序列的dsRNA,体外饲喂后,通过RNA干扰（RNAi）,能够显著降低蚜虫体内细胞色素P450的表达水平,直至导致目的基因沉默和蚜虫死亡。     

四个小麦抗穗发芽分子抗性标记有效性的验证与评价

成熟期穗发芽是一种世界性灾害, 严重影响小麦品质和产量。本试验利用已报道的4个与穗发芽抗性相关的标记, 即STS标记MST101、STMS标记wmc104、QTL位点Xgwm155与Vp1B3, 结合穗发芽率分析,对95份中国小麦地方品种和历史品种的穗发芽抗性进行筛选, 旨在从中筛选出抗穗发芽品种, 并对这4个分子标记的有效性进行比较, 筛选出可用于种质资源筛选和分子标记辅助育种的高效分子标记。结果表明, Vp1B3和Xgwm155与穗发芽抗性相关, 而MST101和wmc104与穗发芽抗性无关。比较而言, Vp1B3更能有效地用于筛选穗发芽抗性品种, 但将Vp1B3和Xgwm155结合起来筛选抗穗发芽小麦品种, 会提高选择效率。     

扁蓿豆遗传多样性的研究

在蛋白质水平上对内蒙古不同生境条件下生长的扁蓿豆的遗传多样性进行了研究。结果表明，内蒙古地区扁蓿豆的蛋白质多样性程度较高；同一种或地下分类单位，由于材料来源不同所表现的基本蛋白图谱与地理分布有关，基本上与草地区划中的地段相吻合，因此在以后进行材料收集时应以地段为单位进行，而在地形单位和植被组合变化较大的地段需要配合地片进行；种子贮藏蛋白在不同的分类单位中表现出较高的同源性，因此可以做为进化标志，而     

用基因枪法获得转异天南星基因aha抗蚜虫小麦

凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白,对蚜虫等害虫有很强的抗杀作用。利用异天南星凝集素基因aha(Arisaema heterophyllum agglutinin)以及水稻Rubisco小亚基启动子,构建了aha基因植物绿色组织特异性表达载体,并采用基因枪转化方法, 与携带bar基因的pAHC20载体共转化到小麦品种科农199中。经过愈伤诱导、再生和筛选以及PCR鉴定,获得aha转基因植株42株,平均转化效率为2.41%。对转aha基因植株后代PCR鉴定表明,T₁代转基因植株的分离比例基本符合孟德尔遗传规律。利用室内多目标综合判别法评定抗蚜虫特性,8个T₁代转基因株系中有高抗材料1份,低抗材料3份,占参试比例44.4%。本研究为获得抗蚜虫转基因小麦新材料奠定了基础。     

红粒小麦Tamyb10单倍型检测及其与穗发芽抗性的关系

穗发芽是影响小麦品质和产量的重要因素之一,通常红粒小麦比白粒小麦具有较高的穗发芽抗性。转录因子Tamyb10是R-1基因的强候选基因,其表达与否和表达水平决定小麦籽粒颜色。为阐明Tamyb10单倍型与红粒小麦穗发芽抗性的关系,利用已开发的Tamyb10基因分子标记,检测119份来自不同麦区的红粒小麦材料,发现Tamyb10基因(Tamyb10-A1、Tamyb10-B1和Tamyb10-D1位点)可分成7类单倍型,分别是baa、aba、bba、aab、bab、abb和bbb。Tamyb10-D1对穗发芽抗性影响最大,Tamyb10-B1次之,Tamyb10-A1作用最小。Tamyb10单倍型没有明显的地域分布特点,但在东北春麦区,Tamyb10单倍型bbb与红粒品种的高穗发芽抗性相关。     

基因枪转化小麦主要轰击参数的优化

基因枪转化是目前小麦遗传转化的主要方法。影响基因枪转化效率的主要参数有轰击距离、轰击压力、DNA总量及浓度、金粉颗粒大小及用量等。为改善目前小麦遗传转化效率偏低的现状, 以普通小麦品种科农199为受体材料, 设金粉大小(0.6 μm和1.0 μm)、轰击距离(5.5 cm和8.5 cm)及轰击压力(650、900和1100 psi)三因素共12个处理, 利用pAHC25质粒转化小麦幼胚, 以确定最佳轰击参数, 建立稳定高效的普通小麦基因枪转化体系。结果表明, 3个因素的不同组合对幼胚的愈伤诱导效率没有明显影响, 但对再生率影响较大, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm的再生率最高。3个因素组合的不同处理对GUS瞬时表达有明显影响, 以金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi处理的GUS瞬时表达量最高。本试验最终获得28株转基因植株, 其中12株来自金粉0.6 μm、轰击距离5.5 cm和轰击压力650 psi的处理, 该处理的平均转化率达2.66%。