正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。     

肉品中两种致病菌的双重PCR快速检测技术的研究

[目的]建立一种同步检测肉品中金黄色葡萄球菌与沙门氏菌的双重聚合酶链式反应.[方法]采用7.5;氯化钠肉汤和GN增菌剂分别对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌进行增菌,根据金黄色葡萄球菌的femA基因与沙门氏菌的invA基因设计引物,通过PCR反应对目标基因进行扩增,并对反应体系进行优化.[结果]特异性实验显示引物特异性良好,经双重体外扩增体系优化显示条带清晰,无非特异性的扩增条带.[结论]双重PCR是一种灵敏度高的快捷检测方法,可为这两种致病菌的同时检出提供新途径.     

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3~5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。     

猪肉及其制品中几种病原微生物芯片检测方法的建立及应用

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、单增李斯特氏菌和空肠弯曲杆菌检测的基因芯片方法,并在实际应用中检测芯片的效果。[方法]以5种目标菌保守基因片段为模板设计引物,用待检样品增菌后提取的DNA模板进行2个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交,用芯片扫描仪对芯片杂交结果进行扫描并判定结果。[结果]使用基因芯片检测5种细菌的检测下限分别为：金黄色葡萄球菌8.7×105cell/ml;大肠杆菌O157：H7 5.0×105cell/ml;沙门氏菌4.4×105cell/ml;单增李斯特氏菌2.4×105cell/ml;空肠弯曲杆菌6.2×106cell/ml。[结论]与传统方法比较,芯片法具有较高的特异性和灵敏性,是一种能应用于实际的快速高通量检测细菌的方法。     

牛乳中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测法

建立牛奶乳样中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法。根据产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列分别设计了2对特异性引物,分别从产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌参考菌株的肉汤培养物中提取DNA,进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验和临床样品检测。经过PCR反应条件的优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法,均扩出了相应的目的条带。该方法将参考菌株的肉汤培养物稀释1 000倍后仍可扩出目的条带,且对大肠埃希菌等的PCR检测为阴性。对临床采集的50份乳品样本分别用细菌分离培养法和PCR方法进行检测,两种方法的符合率达90%以上,但双重PCR检测方法具有特异性强和敏感性高的特点。     

浓缩苹果汁中3种污染菌多重PCR检测方法的建立

根据大肠杆菌的β葡糖醛酸酶基因(uid)、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因(invA)和金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc),分别设计3对特异性引物,通过对单管多重PCR扩增的特异性、敏感性以及扩增条件进行优化.结果表明:3对引物分别能扩增出147bp、570bp和280bp的特异性条带,反应条件优化后,3种目的菌在104 CFU/mL时均可同时扩增出较清晰条带(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在103 CFU/ml浓度下仍然可见到条带),仅沙门氏菌的检测比单基因PCR低一个稀释度,人工模拟果汁污染试验结果稳定.该方法操作简单、快速、特异性强,灵敏度高,能够实现对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种菌的快速诊断检测和生产过程监控.     

兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立同时检测兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的双重PCR检测方法,本研究根据金黄色葡萄球菌的nuc基因和支气管败血波氏杆菌的fimN基因的保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,成功建立兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法。该方法对兔多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和魏氏梭菌的检测结果为阴性;能够检出5pg的金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的基因组DNA;与单重PCR检测方法的符合率为100%。说明本试验建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和准确性,为兔金黄色葡萄球菌和支气管败血波氏杆菌的鉴别诊断提供了有效的技术手段。     

同时检测四种病原菌的PCR方法研究

(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法.(方法)本研究针对大肠杆菌的(16s-23s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化.(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右.(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础.     

食品中金黄色葡萄球菌PCR检测方法的建立

目的:建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌的PCR方法。方法:优化金黄色葡萄球菌DNA提取方法并设计基因特异性引物,采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)编码基因,验证检测的特异性及灵敏度。结论:所检出的金黄色葡萄球菌在497bp处出现特异片段,该方法具有较高的敏感性和特异性,可作为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的手段。     

禽致病性大肠杆菌O_1、O_2、O_(78)血清型三重PCR检测方法的建立

[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O_1、O_2和O_(78)血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl_22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O_1、O_2、O_(78)最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O_1和O_2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL~(-1),O_(78)血清型的DNA最低检测限为0.02 ng·μL~(-1);以O_1、O_2和O_(78)混合DNA为模板时,最低检测限为0.05 ng·μL~(-1)。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O_1、O_2和O_(78)3种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。     

羊流产衣原体的PCR检测方法研究

根据羊流产衣原体16SrRNA基因保守序列,设计合成一对引物,通过优化PCR反应条件,成功地扩增出预期的523bp片段,而沙眼衣原体、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及健康鸡胚的卵黄囊膜均未扩增出相应的片段。敏感性试验表明,该体系可检测到2pg的衣原体DNA。     

PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌

【目的】利用PCR技术,无需增菌，直接检测乳品中的金黄色葡萄球菌。【方法】通过溶剂提取的方法从人工样品中提取模板，以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）为靶基因，经过PCR扩增得到279 bp的产物。经过DNA测序证实该产物为目的扩增产物。采用PCR方法实际检测了乳品中的金黄色葡萄球菌，同时，与国标GB 4789.10-94方法及两种快速检测致病性金黄色葡萄球菌测试片Petrifilm RSA.Count Plate 及Baird-parker+RPF Agar进行了比较。【结果】PCR方法的灵敏度高，全脂乳和脱脂乳检测的检出限为10 CFU/ml，奶酪检测的检出限为55 CFU/g，可在6 h内完成对乳品中金黄色葡萄球菌的检测，比目前普遍采用的先增菌再进行PCR检测的方法缩短了12～24 h。与国标方法相比，PCR方法的符合率为94.3％，敏感性为100％。【结论】采用溶剂提取制备模板的方法可有效的用于PCR直接检测(无需增菌)乳及乳制品中的金黄色葡萄球菌。     

Detection of Staphylococcus aureus in Dairy Products by Polymerase Chain Reaction Assay

A polymerase chain reaction （PCR） assay was employed for direct detection of Staphylococcus aureus without enrichment in dairy products. A solvent extraction procedure was successfully modified for the extraction of Staphylococcus aureus DNA from artificially contaminated whole milk, skim milk, and cheese. A primer targeting the thermostable nuclease gene （nuc） was used in the PCR. A DNA fragment of 279 bp was amplified. The PCR product was confirmed by DNA sequencing. In this study, the PCR, GB-4789.10-94, Perifilm RSA.Count Plate, and Baird-Parker ＋ RPF Agar were compared. The sensitivity of the PCR was 10 CFU mL^-1 of whole milk, skim milk, and 55 CFU g^-1 of cheese. The developed methodology allowed for detection of Staphylococcus aureus in dairy products in less than 6 h. The time taken for the development of this PCR assay was 12-24 h, less than the time taken by the general PCR assay using the enrichment method, and the coincidence rate of this developed PCR was 94.3%, the sensitivity was 100%. It was a rapid, sensitive, and effective method for PCR to detect Staphylococcus aureus in milk and milk products.     

4种食源性致病菌的PCR-SSCP检测技术研究

采用细菌的16S rDNA保守区引物作为通用引物,对常见食源性致泻大肠埃希氏菌(Diarrheogenic Escherichiacoli)、沙门氏菌(Salmonellae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)进行PCR扩增,产物及其XmnI酶切后产物进行单链构象多态性分析。试验结果显示,4种食源性致病菌的PCR产物经XmnI酶切后进行单链构象多态性分析可以相互区别。因此,PCR-SSCP技术可以方便地用于检测食源性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌。     

大鲵不同部位的抑菌效果研究

[目的]研究大鲵皮肤、黏液、肉粉和脂肪的抑菌效果。[方法]用80%甲醇水溶液分别浸提大鲵粘液、皮肤及肉粉获取提取物,用乙醚萃取大鲵油。采用滤纸片扩散法,研究大鲵4种提取物对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌的抑菌作用。[结果]大鲵皮肤浸提物对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌有较强的抑菌作用,而对大肠杆菌无抑制作用。大鲵黏液、大鲵肉粉、大鲵油对4种菌的抑制作用均不显著。[结论]大鲵的主要抗菌部位为皮肤。     

链球菌通用PCR检测方法的建立及应用

为建立链球菌快速检测方法,根据链球菌延伸因子EF-Tu基因设计合成1对通用引物,对链球菌属及其他属细菌进行PCR检测.结果表明,所设计的通用引物对猪链球菌2型和无乳链球菌均能扩增出1条大小为197 bp的特异性DNA条带,而对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌、都柏林沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌均呈阴性反应;经对PCR产物进行测序分析表明,扩增片段与GenBank上链球菌相应序列的同源性达90%～98%;对链球菌DNA样本不同稀释度的检测显示,该PCR的最低检出量可达0.1 ng/mL;利用PCR检测方法对11株链球菌分离物进行检测,结果均能扩增出与预期大小相一致的目的条带,与传统生化鉴定结果符合率达到100%.这些结果表明,已成功建立了链球菌PCR检测方法,并可应用于临床链球菌的鉴定.