紫草与大青叶提取物体外抑菌效果研究

[目的]研究紫草[Arnebia euchroma（Royle） Johnst]与大青叶（Isatis indigotica Fort）提取物对6株腐败微生物和致病菌的抑菌性能及其最小抑菌浓度（MIC）。[方法]采用滤纸片扩散法。[结果]紫草提取物对猪粪链球菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.03、0.03、0.08、0.11mg/ml,而对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果相对较弱。大青叶提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、炭疽杆菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.08、0.19、0.20、0.56mg/ml,而对猪粪链球菌和大肠杆菌的抑制效果较差,MIC分别为1.08、1.16mg/ml。[结论]为开发和应用大青叶与紫草提取物作为功能性天然防腐剂提供参考。     

高通量基因芯片在压载水中检测致病菌的应用

在口岸压载水检测中发现有多种食源性致病菌的存在,给公共卫生和口岸生态环境带来极大风险。目前对食源性致病菌的检测主要是通过细菌的培养及生化鉴定、荧光PCR等方法,但是不能同时检测多种致病菌。本研究针对一种能检测12种食源致病菌的芯片进行了应用研究,用参比菌株和实验室自分离的菌株检测该芯片的特异性,结果表明该芯片的特异性良好,在所检测的菌株之间无交叉反应。在DNA水平上可以检测到110~7 000 copy的DNA分子,在菌裂解液的水平上可以检测到104~105copy数目的菌体,样品添加实验证明1 cfu/m L的菌浓度就可以通过增菌后芯片检测到。该芯片可鉴别金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、肠出血性大肠杆菌O157∶H7、霍乱弧菌、志贺氏痢疾杆菌、空肠弯曲杆菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、弯曲肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌和产气荚膜杆菌等。研究证明该芯片的灵敏度比PCR水平略低,但是其具备高通量、快速、准确,简单易操作等优点,可以应用于口岸压载水中携带食源致病菌的快速检测。     

环介导恒温扩增检测生鲜果蔬中致病菌

本试验以8种生鲜果蔬为研究对象,采用环介导恒温扩增(LAMP)方法,检测其中沙门氏菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌和单增李斯特菌,并与国标方法进行比较。结果表明,LAMP方法和国家标准方法检测结果一致,符合率为100%,重复性好,灵敏度≤5 CFU/g,特异性高。因此,LAMP方法可广泛应用于蔬菜水果中致病菌的快速检测。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取hlyA基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。     

山东省市售畜禽肉蛋产品中食源性致病菌污染状况分析

为了解山东省市售畜禽肉蛋产品中食源性致病菌的污染状况,我们于2017年在山东省德州、临沂、济宁3地市采集畜禽肉蛋样品,共计8类360份样品,并对其中常见食源性致病菌(沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157、空肠弯曲杆菌)的污染状况进行分析。结果表明,360份畜禽肉蛋产品中,4种食源性致病菌检出率为40.8%(147/360)。其中,空肠弯曲杆菌在猪肾中检出率最高,为53.8%(7/13);金黄色葡萄球菌在猪肉和牛肉中检出率最高,分别为26.7%(24/90)和26.7%(8/30);沙门氏菌在猪肝中检出率最高,为5.9%(1/17);大肠杆菌O157均未检出。综上,山东省市售畜禽肉蛋产品中污染的食源性致病菌主要以空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌为主,建议相关部门针对性加强对畜禽蛋产品市场的监管及风险监测工作。     

正交优化多重PCR反应体系检测3种食源性致病菌的研究

[目的]建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌的快速、敏感、特异的多重PCR检测方法。[方法]根据金黄色葡萄球菌的nuc基因、沙门氏菌的IpaB基因、志贺氏菌的ipaH基因,设计3对特异性引物进行多重PCR检测,利用正交设计对多重PCR反应体系的镁离子、Toq酶、dNTP、引物的浓度在4个水平上进行L16（4^4）优化试验,并确定该检测方法的特异性与灵敏度。[结果]3对引物能特异性扩增出210、280、393bp的目的条带。利用FTA滤膜提取模板DNA,采用建立多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为3．5×10^2 cfu／ml、沙门氏菌为2．2×10^2 cfu／ml、志贺氏菌为1．0×10^2 cfu／ml。[结论]该检测方法准确、快速、高效,为同时检测食品中多种致病菌奠定了基础。     

PCR法检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

[目的]建立一种快速准确检测水中金黄色葡萄球菌肠毒素A的方法。[方法]将金黄色葡萄球菌模拟污染的水增菌后提取菌体DNA,以沙门氏菌、大肠杆菌DNA和空白作对照,用PCR法扩增金黄色葡萄球菌肠毒素A基因。[结果]金黄色葡萄球菌DNA的检测结果呈阳性,检测底限达100 cfu/L,而大肠杆菌和沙门氏菌及空白对照均未出现特异性片段,整个检测过程只需要24 h。[结论]试验建立的PCR方法可检测水及类似食品中的金黄色葡萄球菌SEA基因,并具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作的特点。     

几种放线菌处理后对猪粪中主要病原菌和恶臭产生菌的影响研究

采用室内培养方法,研究评估了细黄链霉菌（Streptomyces microflavus）、抗生链霉菌（Streptomyces antibioticus）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus）三种放线菌及其组合对猪粪中主要病原菌的影响,并对其体外的抑菌作用机理进行了初步探讨。结果表明,接菌处理能有效减少猪粪中的沙门氏菌（Salmonella spp.）、病原性大肠埃希氏菌（Escherichia coli O157）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter spp.）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenos）的数量。与对照组相比,单独添加细黄链霉菌组后猪粪中空肠弯曲杆菌的数量从3.1×101cfu·g^-1降至不可检测。放线菌胞内外活性混合物质的体外抗菌试验的结果显示,不管是单独处理还是几种放线菌的复合处理都对供试的大肠杆菌、梭菌、优杆菌、沙门氏菌、病原性大肠埃希氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌表现出一定程度的抑制作用,在抑菌能力方面,单独添加细黄链霉菌的效果优于其他各组。     

贵阳市市售鸡肉中五种食源性致病菌污染状况调查研究

对贵阳市市售鸡肉中5种食源性致病菌的污染情况进行调查,结果表明:50份样品中食源性致病菌总检出率为48%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为24.0%、22.0%、6.0%、2.0%、0,40份冻鸡肉样品的检出率为55%,10份鲜鸡肉样品的检出率为20%。对农贸市场市售冻鸡肉样品进行抽查,34份样品中5种致病菌的检出率为58.8%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为32.3%、17.6%、5.9%、2.9%、0;对6份超市冻鸡肉样品进行检测,食源性致病菌的检出率为33.3%,其中空肠弯曲菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和单核细胞增生李斯特菌的检出率分别为0、16.7%、16.7%、0、0。     

叠氮溴化丙锭对食品中单增李斯特氏菌检测结果的影响

为研究叠氮溴化丙锭(PMA)在单增李斯特氏菌检测中的作用,利用实时荧光PCR方法检测不同浓度PMA处理的单增李斯特氏菌标准菌株CMCC 54004的死菌和活菌核酸的扩增情况。结果显示,1.0 mg/ml PMA能有效抑制单增李斯特氏菌死菌核酸的扩增。经过PMA处理后单增李斯特氏菌死菌与未经PMA处理的检测结果间差异极显著,而PMA处理后CMCC 54004活菌与未经PMA处理的检测结果间差异性不显著。通过对PMA处理的CMCC 54004死菌、活菌、不同比例死菌与活菌混合液以及其在不同食品基质下的检测结果的比较,进一步证实,1.0 mg/ml PMA在单增李斯特氏菌检测中能有效减少死菌核酸的影响,提高检测结果的可靠性。     

港口航道致病性细菌检测微阵列基因芯片的研制

[目的]制备出一套针对港口航道致病性细菌检测的基因芯片,为港口航道基因芯片检测技术的研究及应用打下基础.[方法]采用常规方法提取目标菌株基因组DNA,以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守区引物进行PCR扩增,使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25对扩增获得的目的片段进行寡核苷酸探针设计,经PCR筛选验证,目标探针以氨基化修饰后通过芯片点样仪点制在醛基玻片上;优化芯片杂交固定条件,并用于港口航道的水样检测,以验证微阵列基因芯片的检测效果.[结果]优化后的芯片杂交固定条件为探针点样浓度10μmol/L、紫外交联时间2.0 h、杂交温度65℃,有效提高了基因芯片检测的灵敏度,与传统检测方法相比可实现快速、高通量、准确的目标.研制的微阵列基因芯片可特异性检测出港口航道中含有的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)、溶藻弧菌(V.alginolytivus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和创伤弧菌(V.vulnificus)等7株致病性细菌,且均未出现非特异性杂交.[结论]针对港口航道致病性细菌建立的微阵列基因芯片检测技术具有特异性强、灵敏度高、快速便捷的特点,可用于港口航道及周边地区的海洋环境监测和海产品质量安全检测.     

猪链球菌2型基因芯片检测技术的建立

选取猪链球菌2型的cps2J基因设计引物和探针,通过PCR扩增Cy3标记的DNA片段与固定于芯片上的探针进行杂交,并将杂交完毕的芯片进行信号扫描分析,根据荧光信号的强度来确定是否存在猪链球菌2型。结果表明,采用浓度为5μmol/L的探针与PCR产物杂交30min即可得到清晰的荧光信号,表明基因芯片检测技术是一种灵敏度高、特异好的检测方法。该方法的建立可以快速有效地对猪链球菌2型做出诊断,具有较好的应用前景。     

2种基因漂移检测方法对比及其影响因素分析

[目的]针对田间基因漂移常用的PCR检测或蛋白检测方法,确定2种方法检测结果的一致性及其环境影响因素。[方法]通过设计环境因素和对大量样本使用PCR检测和蛋白检测方法,对3个处理（风力处理、蜜蜂处理和空白对照）下3个品种共计1769个样本进行了双重检测。[结果]田间基因漂移存在基因转入但不表达的现象,即PCR检测和蛋白检测结果并非完全一致。环境因素中,风力处理和蜜蜂处理对基因表达无显著影响,但蜜蜂处理的基因表达率高于风力处理。[结论]为基因漂移的精确检测提供了参考。     

2种基因漂移检测方法对比及其影响因素分析

[目的]确定针对田间基因漂移常用的PCR检测或蛋白检测方法2种方法检测结果的一致性及其环境影响因素。[方法]通过设计环境因素和大量样本的PCR检测和蛋白检测方法,对3个处理（风力处理、蜜蜂处理和空白对照）下3个品种共计1769个样本进行了双重检测。[结果]田间基因漂移存在基因转入但不表达的现象,即PCR检测和蛋白检测结果并非完全一致。环境因素中,风力处理和蜜蜂处理对基因表达无显著影响,但蜜蜂处理的基因表达率高于风力处理。[结论]为基因漂移的精确检测提供了参考。     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

基于PCR技术检测肠球菌esp基因的引物选择及其初步应用

现今全球水域环境受到人类活动的影响,粪便污染日趋严重,因此确定水环境是否存在粪便污染对公众健康、环境治理等方面具有重要意义.以人类肠道致病痛原体肠球菌中的esp基因作为检测水体中人类粪便污染的分子标记,从3对具有代表性的引物中选择最佳引物,建立PCR检测方法,得到了较佳的PCR反应条件,并初步应用于湖北武汉地区南湖水中...     

安氏隐孢子虫ITS-1基因PCR检测方法的建立

[目的]建立针对安氏隐孢子虫的PCR快速检测方法,为安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查提供技术支撑.[方法]根据GenBank中安氏隐孢子虫的ITS-1基因序列设计1对特异性引物,建立基于ITS-1基因的PCR方法,并通过特异性试验、敏感性试验、临床检测以及与经典巢式PCR检测方法进行比较等,验证其可行性.[结果]基于ITS-1基因的PCR检测方法能扩增出安氏隐孢子虫的特异条带,而对猪源隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、微小隐孢子虫、牛泰勒氏虫、牛巴贝斯虫、伊氏锥虫、食道口线虫的扩增结果均为阴性;将测序结果进行BLAST比对,发现其与GenBank中安氏隐孢子虫的同源性均在99%以上.敏感性最低可检测每克牛粪中5个卵囊;用于检测广西不同地区的1613份牛粪样品时,与经典巢式PCR检测方法相比,发现两者的阳性检出率均为11.72%,且吻合率达100%.[结论]安氏隐孢子虫ITS-i基因PCR检测方法具有快速、敏感、特异的特点,适用于安氏隐孢子虫的检测和分子流行病学调查分析.     

南美白对虾养殖系统中氨氧化菌多样性研究

[目的]为解决养殖水体的氨氮污染问题提供依据。[方法]研究南美白对虾养殖池塘底泥中的氨氧化菌的多样性和种群分布及其amoA基因的多样性,并与池塘周边土壤中的氨氧化菌群落结构进行比较。[结果]不同样品中氨氧化菌数量差异显著,其中池塘周边土壤中最多,达到4.5×105cfu/g,其次是池塘底泥和水体。来自土壤和底泥两个DNA样品均扩增到了预期长度(491 bp,517 bp)的amoA基因片段。底泥样品的DGGE条带数明显多于池塘周边土壤样品。土壤和底泥样品仅有1个共同的氨氧化菌种属,其序列与Nitrosospira sp.相似性达96%。池塘周边土壤的氨氧化菌种属序列与Nitrosospira sp.都有高度同源性。池塘底泥中Nitrosomonas sp.为氨氧化菌的优势菌群。[结论]构建的amoA基因克隆文库能较好反映南美白对虾养殖系统中氨氧化菌的多样性。     

多重PCR检测四种食源性病原弧菌

【目的】建立在扩增内标存在下同时快速检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌4种食源性致病菌的五重PCR方法。【方法】以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立多重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的五重PCR应用于弧菌的筛选。【结果】建立的多重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌的灵敏度达10 CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105 CFU/mL,经特异性评价证实其特异性好,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够快速、灵敏、准确地检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌4种食源性致病菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,适用于食品中常见致病性弧菌的快速筛检。     

四重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45

【目的】建立多重PCR检测抗除草剂转基因油菜T45的方法,为其转基因检测提供技术支持。【方法】选择油菜内源参照基因CruA、外源基因P-CaMV 35S、T-CaMV 35S和pat作为四重PCR检测基因,特异性引物序列参照国家相关标准或文献,通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化、灵敏度测试及已知样品验证,建立抗除草剂转基因油菜T45多重PCR检测体系。【结果】多重PCR的适宜退火温度为58℃,适宜引物终浓度(μmol/L)配比CruA∶P-CaMV 35S∶T-CaMV35S∶pat为0.1∶0.2∶0.2∶0.2,方法灵敏度为0.01 ng/μL,所有已知样品的扩增条带与其分子特征显示的外源基因元件完全一致。【结论】建立的抗除草剂转基因油菜T45品系四重PCR检测方法可实现在一个反应体系中同时检测抗除草剂转基因油菜T45内源参照基因和多个外源基因成分,为转基因油菜T45提供了一种有效的检测手段。