小麦PR5Ks蛋白家族鉴定与分析

类PR5受体蛋白激酶（PR5 receptor-like protein kinase,PR5Ks）包含病程相关蛋白5(PR5)和激酶结构域,为植物类受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase,RLK）家族的1个亚族,与植物的抗病防御反应相关。本研究从小麦基因组中鉴定了17个PR5Ks基因,对其理化性质、基因结构、保守基序和启动子进行分析。结果表明,17个PR5Ks蛋白家族成员均为疏水性蛋白,氨基酸数目在415～663个,分子量在44.60～73.52 kD,等电点介于5.61～8.4,蛋白结构以无规则卷曲和α螺旋为主。顺式作用元件分析显示,在小麦PR5Ks基因转录起始位点上游2 000 bp序列中存在多种响应元件,包括SA、MeJA、厌氧诱导、低温等响应元件。为了明确17个小麦PR5Ks成员是否具有抗病性,对小麦在赤霉菌（Fusarium graminearum）和条锈菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）侵染过程中PR5Ks基因的表达规律进行分析,发现TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11受赤霉菌和条锈菌的共同诱导。利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测了接种叶锈菌的小麦中基因的表达模式,结果显示,TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11这4个基因均受叶锈菌诱导且在抗病植株中高表达,表明他们在小麦与叶锈菌的互作中发挥正向调控作用。综上所述,本研究初步筛选到4个与小麦抗病相关的PR5Ks基因,为进一步揭示PR5Ks蛋白家族参与小麦生长发育及抗病防御反应提供参考。     

条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因,研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦兴资9104中,分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术,分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因,命名为TaPR10,ORF长483 bp,编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内,除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外,还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列,其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明,TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调,成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因,该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16 h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30 d的植株中,转-220～0 bp片段的GUS染色最少,转-524～0 bp及-468～0 bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0 bp和-468～0 bp 2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1 150～0、-800～0、-220～0 bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（South-ern杂交结果）;-800～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1 150～0 bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220 bp存在提高启动子活性调控元件,-1 150～-524 bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

非生物胁迫对水通道蛋白启动子活性的调节作用

前期通过染色体步移法克隆得到巴西蕉水通道蛋白基因MaPIP1-2上游841 bp的启动子序列,分析其启动子序列含有响应干旱和高盐等非生物胁迫的顺式作用元件。为了进一步研究该启动子的功能,成功构建MaPIP1-2基因启动子的植物表达载体,并且转化拟南芥,在MaPIP1-2::GUS转基因拟南芥中发现,MaPIP1-2启动子活性受到干旱和高盐的诱导表达,随着浓度增加,其启动活性增强。     

利用GFP-Trap和酵母双杂交技术筛选TaPR1互作靶标

病程相关蛋白PR1(pathogenesis related PR1 proteins, PR1)在小麦抗病防御反应中发挥重要作用。本试验是在前期研究基础上,借助烟草成功表达TaPR1蛋白,利用GFP-Trap技术结合质谱分析获得与TaPR1互作的蛋白。同时,利用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, Y2H)在接种叶锈菌生理小种PHNT的‘中国春’小麦酵母文库中筛选获得与TaPR1互作的寄主蛋白。经过序列比对分析,2种方法共同筛选出谷氨酰氨合成酶(Glutamine synthetase)、细胞色素b6(Cytochrome b6)、应激蛋白(Stress protein)等可能与TaPR1互作的蛋白,为进一步深入研究TaPR1参与小麦叶锈病防御反应的分子机制提供了理论基础。     

水稻OsN1基因5’端启动子不同区域序列分析

为了研究水稻OsN1基因启动子(OsN1p)的表达调控机理,用OsN1基因ATG(ATG中的A为0)上游-1 089 bp、-881 bp、-489 bp和-245 bp的启动子序列分别取代pBI121中的35S启动子,构建植物表达载体pBIN1.1p、pBIN0.9p、pBIN0.5p和pBIN0.2p。将这些表达载体经农杆菌介导转化水稻日本晴,获得转基因植株。对启动子的表达特点和启动活性进行了分析,结果表明,由-1 089 bp启动子、-881 bp启动子和-489 bp启动子驱动的gus基因能在愈伤组织中表达,-245 bp启动子不能驱动gus基因在愈伤组织中表达,说明启动子OsN1p具有启动活性的最小启动序列为ATG上游的-489 bp;-489 bp启动子驱动的gus基因在转基因植株根中表达,在根冠不表达;用5 mmol/L水杨酸(SA)喷施转基因植株叶片后,GUS定量分析结果表明转基因植株的GUS活性增高,转-881bp启动子植株的GUS活性比转-1 089 bp启动子植株的活性高。可见,启动子OsN1p具有组织特异性表达和受SA诱导表达的特性。     

植物β-1,3-葡聚糖酶的研究进展

植物β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-D-葡聚糖-3-葡萄糖苷水解酶，EC3．2．1．39）属PR2（Pathogensis—relatedpmteins，PR）类蛋白，作为植物抗真菌基因工程的热点之一，近年来的研究进展较为迅速。文章就β-1，3-葡聚糖酶的生物特性、分类、诱导、抗性和发育进行了竦合性介绍。     

西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因启动子的克隆及活性测定

【目的】克隆测定西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因（Fatty Acid Synthase,FAS）启动子的全长序列,进行活性区域分析,为奶山羊FAS基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】根据牛和人脂肪酸合酶基因启动子的同源序列以及西农萨能奶山羊脂肪酸合酶基因5′UTR区域,分别设计上、下游引物,以西农萨能奶山羊全血DNA为模板克隆启动子序列。依据生物信息学分析结果重设引物,将FAS启动子基因分段克隆并连接到荧光素酶表达载体PGL-3,与Psv-β-半乳糖苷酶对照载体共转染293、MCF-7细胞,进行荧光素酶活性检测和β-半乳糖苷酶的活性检测。【结果】FAS基因启动子序列全长2 640 bp,与牛、人FAS启动子序列同源性90％以上,包括数个潜在SP1、Ets、LSF等转录因子结合位点和CCAAT框、GC框。-1 040—-340 bp处可能包含启动子活性中心,通过启动子缺失片段试验将活性中心范围缩小至-721—-540 bp之间。【结论】通过克隆FAS基因启动子区域,分析表明启动子前端存在负调控元件,找出了启动子最小活性中心。     

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。