条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白TaPR10基因的克隆及特征分析

 【目的】克隆条锈菌诱导的小麦病程相关蛋白PR10基因，研究其在小麦成株抗条锈病防御反应中的作用。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术，从条锈菌侵染的小麦兴资9104中，分离病程相关蛋白10基因;采用生物信息学技术预测分析该基因的DNA序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用实时荧光定量RT-PCR技术，分析该基因在小麦成株期和苗期受条锈菌CYR32侵染后的表达情况。【结果】分离到病程相关蛋白10基因，命名为TaPR10，ORF长483 bp，编码由160个氨基酸组成的蛋白质TaPR10;TaPR10不含跨膜区、无信号肽、定位在胞内，除具有典型的病程相关蛋白Bet_v_I家族保守结构域外，还有其它4类功能保守域;与小麦、高粱、玉米和水稻等4种植物PR10蛋白的氨基酸序列相似性在80%左右;TaPR10 DNA序列内部存在188至271位84 bp的内含子序列，其拼接位点序列具有GT-AG双核苷酸序列;TaPR10基因表达分析的结果表明，TaPR10基因在成株期和苗期反应中表达量均上调，成株期表达高于苗期。【结论】首次分离到一个条锈菌CYR32诱导的小麦TaPR10基因，该基因可能参与了小麦成株抗条锈病防御反应。     

延胡索去甲乌药碱合成酶基因CyNCS1克隆及其表达模式分析

【目的】克隆延胡索去甲乌药碱合成酶（norcoclaurine synthase,NCS）基因,分析其在延胡索异喹啉类生物碱合成中的关键作用。【方法】基于转录组数据库,利用逆转录PCR克隆延胡索CyNCS1基因及其启动子区域序列,采用生物信息学方法分析其编码蛋白的理化性质、结构特征及其启动子区域顺式作用元件,同时进行多序列比对和系统进化树分析,确定其进化关系;利用实时荧光定量PCR对其根、茎、叶及发育早、中、晚期块茎的组织表达模式进行分析;对茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）处理0,4,8,12 h的叶片进行表达谱分析,以体积分数75%酒精溶剂处理为对照（CK）,确定该基因的表达特征。【结果】CyNCS1基因开放读码框长873 bp,编码291个氨基酸,编码蛋白分子量为33.09 ku,等电点为6.90,具有去甲乌药碱合成酶保守的催化结构域（GDGGVGTV/IL、YKEKF和MIEGGHLDMG）,且不含信号肽,预测定位于细胞核中。多序列比对结果显示,CyNCS1与石生黄堇、罂粟的NCS蛋白同源性较高,分别为83.6%和82.1%;系统进化树结果显示,CyNCS1与石生黄堇CsNCS蛋白聚为一支,说明二者亲缘关系较近。该基因启动子区长2 238 bp,包含多种植物激素及低温、热胁迫等环境因子的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果显示,随着发育推进块茎中CyNCS1的表达量显著增高,且受到MeJA和ABA的诱导,MeJA处理8 h时表达量为0 h的3.10倍,ABA处理8 h为0 h的3.16倍;而对照CyNCS1表达量随时间推移无明显变化。【结论】克隆并鉴定了延胡索NCS酶基因CyNCS1,明确了其在发育进程中的表达模式,并确定该基因表达受MeJA和ABA的诱导。     

陕西省泾阳县药用植物资源调查研究

调查陕西省咸阳市泾阳县中药资源物种分布及数量状况，提供必要的分析数据来保障当地中药资源市场的可持续发展。参考《第四次全国中药资源普查(试点)施行方案》，经由对三类代表区域、样地、样方调查以及标本采集，图像和书面记录，并结合历史文献考证等方法研究泾阳县中药资源的多样性。泾阳县现有中药资源77科、187属、226种，依样方统计重点品种含有42种，其中有6种在国家Ⅲ级重点保护的野生药材名录范畴内。泾阳县中药资源的物种分布状况已基本查清，对下阶段普查工作的延伸具备良好的引领意义，普查结果也支持着县域中药文化知识的普及和中药资源市场的可持续发展战略。     

小麦过敏性诱导反应基因TaHIR4的克隆及序列分析

【目的】克隆条锈菌诱导的小麦过敏性反应(Hypersensitive induced reaction,HIR)基因TaHIR4,分析其编码蛋白的结构、进化与功能。【方法】采用电子克隆、RT-PCR技术,从条锈菌侵染的小麦中,分离过敏性诱导基因TaHIR4,并对其进行克隆和序列分析;利用InterProScan、TMpred、SignalP 3.0、PSORT等在线分析工具,预测TaHIR4蛋白的保守结构域、跨膜结构、信号肽、细胞定位等特征;采用DNASTAR软件分别进行氨基酸序列同源性比对和进化树分析。【结果】分离到小麦过敏性诱导基因,命名为TaHIR4(867bp,GenBank注册号为FJ028663),该基因编码1条由288个氨基酸组成的多肽;TaHIR4蛋白含HIR蛋白家族的保守SPFH(Stomatins,Prohibitin,Flotillins,HflK/C)、PHB(Prohibitin homologues)结构域,有4种典型的motifs(蛋白激酶、酪蛋白激酶Ⅱ、酪氨酸激酶磷酸化和N-豆蔻酰化位点),N末端的19个氨基酸序列内部存在跨膜信号肽结构,可能属于分泌蛋白;TaHIR4与HvHIR4蛋白的亲缘关系最近,同源性最高(98%),其次为OsHIR4,同源性为91%。【结论】分离到1个条锈菌诱导的小麦HIR基因TaHIR4,其编码蛋白可能属于分泌蛋白,在胞外行使功能。     

铁皮石斛两个DEAD-box RNA解旋酶基因克隆及特征分析

为获得铁皮石斛DEAD-box RNA解旋酶（RH, RNA Helicase）基因并进行表达及序列分析，利用RACE从其叶片cDNA中分离RH基因，对编码蛋白相关理化特性进行生物信息分析；采用MEGA 6.0构建系统进化树；借助定量PCR技术检测基因表达特性。结果表明：分离到铁皮石斛两个DEAD-box RH基因DoRH1和DoRH2（GenBank注册号KT957555和KT957556），全长为1 648 bp和1 851 bp，各编码1条由428和499个氨基酸组成的肽链，编码蛋白相对分子质量分别为48 206和55 432，等电点5.51和8.65； DoRH1和DoRH2蛋白均包含3个保守的RH结构域和多个基元，无信号肽或跨膜域，预测均定位在细胞核；两个基因与植物DEAD-box RH家族基因相似性高达80%以上；DoRH1、 DoRH2分别聚在拟南芥、水稻、大豆和雷蒙德氏棉DEAD-box RH家族基因进化树的Ⅲ、Ⅳ支；DoRH1和DoRH2表达模式不同，DoRH1在根、茎、叶中表达量无显著差异， DoRH2在根中的相对表达量为叶中的3.26倍，茎与叶中无差异。     

陕西省三原县中药资源普查初报

目的:系统调查和统计陕西省三原县中药资源品种、分布，厘清本县中药资源总量。\[方法\] 依照三原县中药资源普查方案要求，对V2系统随机生成的20个样地进行野外实地调查，通过采集实物制作腊叶标本等进行药用植物一般品种和重点品种调查，同时进行栽培药材品种和传统知识调查统计。\[结果\]共调查样地20个，100个套方，600个样方，中药资源包含恩格勒系统中61个科，149个属，183种，涉及陕西省中药资源重点品种调查名录有43个。三原县栽培品种有皂荚、杜仲、国槐、丹参、月季等。明善堂第五代传人李朝阳在治疗脾胃病、风湿病方面常用方面四神汤加二花炭、独活汤加黑木耳等，效果较好。\[结论\]已基本摸清三原县中药资源总体情况，为该县中药材资源产业发展提供基础数据。     

利用cDNA-AFLP技术分析小麦成株抗条锈性差异基因表达特征

采用cDNA-AFLP技术，对成株抗条锈小麦品种兴资9104在成株期受条锈菌生理小种CY32侵染后5 d内9个时间点的基因表达谱进行了分析。共筛选64对引物，产生32 320个转录本(TDF)；用37对引物检测到2 201个(6.81%)差异TDF，其中926个TDF诱导表达，1 275个下调表达。经大规模克隆、测序分析，最终获得330个差异TDF，聚类分析得到259个EST (unigenes)，命名为aTaPST1至aTaPST259 (GenBank注册号：FL645754~FL646011和FL646262)。经BLASTX比对和功能分类分析，其中96条EST(37.07%)未找到同源性匹配，68条(26.25%)与未知功能蛋白同源性较高；其余95条ESTs主要涉及能量(11.20%)、基础代谢(4.63%)、转录调控(3.86%)、抗病与防御(3.86%)、蛋白质运输和储存(3.09%)、蛋白质合成和细胞生长(各2.32%)、以及信号转导(1.54%)等。选取抗病与防御、转录调控及信号转导类等相关的6个差异基因，qRT-PCR分析结果显示其表达模式符合cDNA-AFLP表达谱。小麦成株抗条锈性分子机制涉及植物多方面生理生化反应，包括抗病与防御、转录调控、蛋白质代谢、信号转导、以及非生物胁迫等多种途径相关基因的协同控制。     

铁皮石斛2个P型H~+-ATPase基因的克隆、表达及生物信息学分析

利用RACE进行铁皮石斛质膜PMA(plasma membrane H~+-ATPase)基因的全长克隆,采用生物信息学方法、DNASTAR 7.0和MEGA 7.0对其编码蛋白结构、序列和分子进化等进行分析,并借助实时荧光定量PCR技术检测基因表达模式。结果表明,从铁皮石斛叶片cDNA中分离到2个P型H~+-ATPase基因 DoPMA1和 DoPMA2(GenBank注册号KU160470和KU160471),各编码1条由973和951个氨基酸组成的肽链;2个基因编码蛋白均含有2个保守的P型ATPase结构域和5个H~+运输ATPase结合位点,不含信号肽,定位在质膜。2个蛋白与植物H~+-ATPases蛋白相似性大于72%,聚在拟南芥、水稻等植物H~+-ATPase分子进化树的Ⅴ和Ⅱ分支。实时荧光定量PCR分析表明, DoPMA1在根和茎中上调,分别为叶中的2.98、1.95倍, DoPMA2在根与叶中表达无显著差异,茎中下调为叶中的0.86倍。研究结果为进一步揭示 DoPMA1和 DoPMA2分子作用奠定基础。