外源蛋白定位马铃薯淀粉粒表达载体的构建

1材料与方法 1．1材料马铃薯品系：郑1011。受体菌：大肠杆菌BL21。载体质粒pCambia1305—1购自TaKaRa公司;反转录试剂、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶购自TaKaRa公司;DNA回收试剂盒Wizard PCR preps DNA Purification System购自Promega公司。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450CYP30581V1基因的诱导表达特征研究

1材料与方法 1．1材料与试剂野桑蚕采自苏州大学独墅湖校区桑园;宿主菌E．coli TOP10为苏州大学基础医学及生物科学学院生物资源与功能基因组学研究室保存;植物次生性物质芸香苷和内源性物质蜕皮激素均购自SIGMA公司;氯氰菊酯购自拜耳杭州作物科学有限公司;外源性化合物NaF（分析纯）购自西安化学试剂厂;RNAiso reagent试剂盒购自TakaRa公司;其他常用试剂购自TaKaRa公司或上海生工生物工程技术服务有限公司：     

靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定

1材料与方法 1．1材料限制性核酸内切酶HindIII、BamHI、PvuII、SspI、质粒抽提试剂盒、EcoT14 DNAMarker购自TakaRa公司。T4DNA连接酶购于promega公司。大肠杆菌DH5α菌株由该实验室保存。siRNA表达载体pSilencer 4．1-CMV Nero质粒购自Ambion公司。     

一种高效提取棉花细胞核的技术

1材料与方法1．1材料二倍体亚洲棉品种石系亚1号,来自中国农业科学院棉花研究所。试剂HEPES购自Amresco公司,DTY购自BioBasicInc．,TritonX-100、PVP40购自Sigma公司,DAPI购自Roche公司,其他试剂均为国产分析纯。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。     

鹅副粘病毒GX1株的HN和F蛋白基因的克隆和序列分析

1材料与方法 1．1病毒来源鹅副粘病毒分离株GX1株由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心实验室分离保存。 1．2试剂及仪器各种PCR反应试剂、PMD-18T载体、胶回收试剂盒、限制性内切酶等均购自宝生物工程（大连）公司。仪器：恒温孵化箱、PCR反应仪、超速离心机、移液器等。     

鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究

1材料与方法 1．1材料 供试鲤鱼购自成都市洗面桥市场。主要试剂：TR—Iaol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司,反转录试剂盒、pMD-18T载体、D12000DNA和如DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司;DEPC原液（Sigma分装）、JM-109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司,其他试剂均为国产分析纯。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

1材料与方法1．1材料1．1．1取材。孕早期成年水牛子宫由南宁某屠宰场提供。1．1．2试剂。一次性细胞培养皿地幻自美同BD公司;新生牛血清购A杭州四季青公司;雌二醇购自宁波市激素制品有限公司;离糖型DMEM细胞培养液粉剂、DPBS粉剂和胶原酶I购自美因GIBCO公司;细胞角蛋白单抗和：二抗购白广州深达生物制品公司。另外,青霉素、链霉素、胰蛋门酶、表皮生氐因子（EGF）、     

利用Asia1型口蹄疫病毒VP1蛋白的单克隆抗体建立单抗竞争ELISA方法

1材料与方法1．1材料新生牛血清购自GIBICO生物公司;青霉素、链霉素购自哈尔滨制药六厂;降脂烷购自sigma公司;过碘酸钠购自上海生物试剂公司;脱脂乳购自飞鹤乳业公司;Babl／c小鼠购自兰州生物制品研究所。     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

1材料与方法 1．1材料随机采集五指山猪品种耳组织样共30份,将其迅速放入液氮带回实验室,-70℃保存备用。 1．2试剂RT—PCRKit、PCR产物纯化回收试剂盒、重组质粒抽提试剂盒,均购自天根生物工程有限公司;SalⅠ、BamHⅠ、pMD18-TVector试剂盒、Ecoli DH5α均购自TaKaRa公司。     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。     

雄性育性基因RNA干扰载体的构建与鉴定(英文)

cDNA fragment of fertility gene MS2 from cotton was cloned by RT-PCR approach, it was highly homologous with relevant genes of Brassica napus and Arabidopsis thaliana. According to the principles of constructing RNAi vector, sense and antisense fragments of MS2 gene carrying restriction endonuclease recognition sites were amplified via PCR technique, ligated with the first intron of upland cotton chinase gene, then inserted into artificially modified plant expression vector pBI121, yielding RNAi vector pBGP12MSIn. The results showed that RNAi vector pBGP12MSIn harboring MS2 gene driven by anther specific promoter BGP was successfully constructed. Our results laid a foundation for studying the function of this gene and genetic transformation of plant male sterile lines.     

甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶基因RNAi载体的构建

通过基因工程手段抑制甘蓝型油菜Δ12-油酸去饱和酶(delta-12 oleate desaturase FAD2)基因的表达,从而使油酸脱饱和产生亚油酸的步骤受阻,达到富集油酸,减少多不饱和脂肪酸含量的最终目的。依据植物RNA干扰的原理和研究中用于构建RNAi载体的基本经验,选择油菜fad2基因片段(510bp)分别以反向和正向的形式插入到油菜napin启动子下游,并在反向和正向插入的基因片段之间即间隔区导入1个来源于豌豆的rbcS-3C基因内含子(83bp)及其剪切位点之前5bp、之后4bp片段。组装完成的fad2RNAi载体转入到植物双元表达载体pCAMBIA3301,植物筛选标记基因采用抗灭生性除草剂PPT的选择基因bar及报告基因gus,从而构建成以甘蓝型油菜fad2基因为靶标的RNAi植物表达载体pCAMBIA3301-fad2i。     

同步抑制棉籽 FAD2 1 与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因 FAD2 1 与FatB的功能区域片段426与501 bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。     

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建(英文)

[Objective] Genetic Engineering technology was used to regulate the expression of PttGA20-oxidase gene thus restrained plant height growth and internode elongation for cultivating dwarfed plant.[Method] Based on the RNAi principle,the gene specific sequences of PttGA20-oxidase in the antisense and sense orientations interrupted by a gene sequence from GUS were cloned into a binary vector pBI121.The selection marker gene npt Ⅱ was replaced with bar gene to RNAi plasmid.[Result] After undergone different endonuclease restrictions,the constructed constraint vector released different segments whose sizes were similar to that of target segment,which demonstrated that the RNAi plasmid of PttGA20-oxidase gene was successfully constructed.[Conclusion] The experiment provided a new way for culturing dwarfed plant.     

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建(英文)

[Objective] Genetic Engineering technology was used to regulate the expression of PttGA20-oxidase gene thus restrained plant height growth and internode elongation for cultivating dwarfed plant.[Method] Based on the RNAi principle,the gene specific sequences of PttGA20-oxidase in the antisense and sense orientations interrupted by a gene sequence from GUS were cloned into a binary vector pBI121.The selection marker gene npt Ⅱ was replaced with bar gene to RNAi plasmid.[Result] After undergone different endonuclease restrictions,the constructed constraint vector released different segments whose sizes were similar to that of target segment,which demonstrated that the RNAi plasmid of PttGA20-oxidase gene was successfully constructed.[Conclusion] The experiment provided a new way for culturing dwarfed plant.     

瓜叶菊‘大花’Mlo基因RNAi载体的构建及其遗传转化研究

为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能以及为将来获得具有广谱与持久的白粉菌抗性瓜叶菊种质资源奠定基础,以瓜叶菊(Pericallis hybrida B.Nord)‘大花’为试验材料,克隆瓜叶菊‘大花’Mlo基因保守片段,构建了瓜叶菊‘大花’RNAi载体;同时构建了瓜叶菊‘大花’高频再生体系;并利用根癌农杆菌介导法转化瓜叶菊‘大花’进而建立了遗传转化体系。经酶切鉴定,成功构建了Mlo基因的RNAi载体质粒pTCK303-mlo-RNAi,构建了瓜叶菊‘大花’高频再生体系,最终确定瓜叶菊‘大花’最佳愈伤诱导培养基为:MS+6-BA 2.4mg/L+NAA 1.0mg/L+KT 0.3mg/L+2,4-D 1.0mg/L;瓜叶菊‘大花’愈伤组织的分化培养最适培养基为:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.1mg/L;瓜叶菊‘大花’生根培养的最佳培养基为1/2MS+NAA 0.5mg·L-1,并且初步探索了瓜叶菊‘大花’Mlo基因转化体系。     

PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体的构建

[目的]通过基因工程手段抑止赤霉素调控基因PttGA20-氧化酶基因的表达,从而抑制植物高生长和节间伸长,达到培育矮化植株的目的。[方法]依据RNAi原理,设计引物扩增正义及反义PttGA20ox片段插入pBI121载体CaMV35S启动子下游区域,并在正义和反义片段间隔区插入茎环结构GUS基因片段,将npⅡt标记基因替换为抗除草剂基因bar,构建dsRNA抑止载体。[结果]所构建的抑止载体经经不同内切酶酶切鉴定后均可释放出与目的条带大小相同片段,表明已成功构建PttGA20-氧化酶基因dsRNA抑止载体。[结论]该研究为培育矮化植株提供了新的途径。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及表达分析

利用i TRAQ技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)HM-40中筛选并克隆到S-腺苷甲硫氨酸合成酶Gh SAMS基因。Gh SAMS基因的开放阅读框全长为1 182 bp,编码393个氨基酸,预测Gh SAMS蛋白质含有15个磷酸化位点,推测其功能的行使可能与激酶磷酸化相关,进化分析表明S-腺苷甲硫氨酸合成酶与茶树(Camellia sinensis)的SAMS蛋白质相似性最高。q RT-PCR分析表明,在接种黄萎病菌VD07菌系后,Gh SAMS表达量逐渐增加,随着接种时间的延长,其相对表达量随之增加,推测其在陆地棉抗黄萎病防卫反应中可能起重要作用。在嫁接棉株中,利用VIGS技术成功地沉默Gh SAMS基因,然后对沉默棉株接种黄萎病菌VD07,鉴定其病情指数为62.5,抗性级别为感病;而转化空载体和未接种载体处理的嫁接棉株病情指数分别为30.0和31.2,抗性级别为耐病,表明Gh SAMS基因沉默后嫁接棉对黄萎病的抗性丧失。推测Gh SAMS基因在陆地棉抗黄萎病的过程中可能起重要作用。     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.