用抗原免疫构建分泌免出血症病毒抗独特型抗体的杂交瘤细胞

用纯化的兔出血症病毒免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。正如网络学说所指出的，从免疫鼠的杂交瘤细胞克隆中，不仅筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ抗体的细胞克隆，同时也筛选出能分泌抗ＲＨＤＶ独特型抗体的杂交瘤细胞，用抗原而不用单克隆抗体免疫，诱导产生抗独特型抗体是一种具有广阔的应用前景的新技术。     

抗IBDV独特型抗体疫苗的制备与应用

应用提取纯化的抗ＩＢＤＶＩｇＧ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０细胞在ＰＥＧ作用下融合，应用ＥＬＩＳＡ法检测筛选，经有限稀释法克隆２次，获得２株（２Ｂ６株，５Ｆ４株）分泌抗ＩＢＤＶ独特型抗体的杂交瘤细胞株，其能诱生ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生高效价的含抗ＩＢＤＶ独特型抗体的腹水。用此独特型抗体分别与福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂按１∶１比例乳化制备成抗ＩＢＤＶ独特型抗体疫苗，免疫接种ＳＰＦ鸡和普通京白公鸡，然后用ＩＢＤＶ野毒株经点眼和滴鼻方式攻毒，保护率分别为８／８、１４／１４，从而证实抗独特型抗体疫苗有潜在的研究和应用价值。     

分泌抗IBDV独特型抗体细胞株的建立

应用提取纯化的抗ＩＢＤＶ ＩｇＧ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，其脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在ＰＥＧ作用下融合，应用ＥＬＩＳＡ法检测筛选，经有限稀释法克隆２次，获得了２株（２Ｂ６株、５Ｆ４株）分泌抗ＩＢＤＶ独特型抗体的杂交瘤细胞株，并能诱生Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生高效价的含抗ＩＢＤＶ独型抗体腹水。     

分泌抗赭曲霉素A单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用赭曲霉素Ａ（ＯＡ）－ＢＳＡ合成抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，取免疫鼠脾细胞与ｓｐ２／０细胞融合，通过克隆和ＥＬＩＳＡ法筛选，建立三株泌抗ＯＡ单克隆抗体杂交瘤细胞株（３Ｃ１２，１Ｄ１２和２Ｇ７）。用间接ＥＬＩＳＡ法测定，细胞上清液抗体效价为１２８＾×（３Ｃ１２）和６４＾×（１Ｄ１２和２Ｇ７）腹水抗体效价为１０＾－７（３Ｃ１２，１Ｄ１２）和１０＾－６（２Ｇ７）。三株单抗（ＭｃＡｂ）均属ＩｇＧ类，分泌抗体     

伊氏锥虫抗独特型抗体疫苗的研究

用纯化的伊氏锥 虫变异表面糖蛋白（ＶＳＧ）免疫大白鼠制备出抗血清，经饱和硫酸铵盐析，ＤＥ－５２纤维素离子交换层析和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ新和层析提取ＶＳＧ特异性多克隆ＬｇＧ抗体。用Ａｂ１免疫大白鼠和家兔制备出抗独特型血清。ＥＬＩＳＡ抑制试验检测结果表明，８份大白鼠抗独特型血清的抑制率高于２５％。用正常大白鼠ＩｇＧ致敏的醛化绵羊红细胞吸收兔抗独特型血清除去异种抗体，采用Ａｂ１－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ     

分泌抗兔出血症病毒单抗杂交瘤细胞株的建立

以纯化的兔出血症病毒免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，应用杂交瘤技术获得了分泌抗ＲＨＤＶ单抗杂交瘤细胞１７株，其中有３株杂交瘤细胞分泌单抗的ＥＬＩＳＡ效价为１：４０９６００，１：４０９６；５株单抗具有血凝抑制活性。兔抗ＲＨＤＶ高兔血清对１７株ＭｃＡｂ的ＥＬＩＳＡ抑株为ＩｇＧ２ｂ。各株ＭｃＡｂ与欧洲棕色兔病病毒无抗原交叉反应，也无沉淀反应特性。     

伊氏锥虫抗独特型抗体疫苗的研究Ⅱ．伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗独特型抗体制备与检测

用纯化的伊氏锥虫变异表面糖蛋白（ＶＳＧ）免疫大白鼠制备出抗血清，经饱和硫酸铰盐析，ＤＥ－５２纤维素离子交换层析和Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析提取ＶＳＧ特异性多克隆ＩｇＧ抗体（Ａｂｌ）。用Ａｂｌ免疫大白鼠和家兔制备出抗独特型血清。ＥＬＩＳＡ抑制试验检测结果表明，８份大白鼠抗独特型血清的抑制率高于２５％。用正常大白鼠ＩｇＧ致敏的醛化绵羊红细胞吸收兔抗独特型血清除去异种抗体，采用Ａｂｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，可从每毫升兔抗独特型血清中获得９７．４微克抗独特型抗体（Ａｂ２）。经ＥＬＩＳＡ抑制试验检测表明，提取的兔抗独特型抗体（Ａｂ２）对Ａｂｌ与ＶＳＧ的结合反应可产生明显的抑制效应，能识别Ａｂｌ的抗原结合部位，其配位的空间构型与ＶＳＧ表位具有相似性。     

猪水泡病病毒抗独特型抗体的研究—Ab2的制备与鉴定

用猪水泡病病毒中和单抗２Ｂ６和４Ｈ９免疫家兔，制备出ＳＶＤＶ兔抗独特型抗体。经亲和层析纯化，用ＥＬＩＳＡ鉴定性质，结果表明，所制备的Ａｂ２能竞争抑制Ａｂ１与ＳＶＤＶ抗原结合，同时，Ａｂ２与Ａｂ１的结合可被病毒抗原阻断，表明所制备的Ａｂ２具有ＳＶＤＶ抗原内影像关系。     

抗绵羊肺炎支原体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用绵羊肺炎支原体（ＭＯ）抗原免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取血清抗体阳性免疫鼠的脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞在聚乙二醇作用下进行融合，产生杂交瘤细胞、用间接ＥＬＩＳＡ法对杂交瘤细胞生长孔上清液进行检测，筛选阳性杂交瘤细胞株．以有限稀释法克隆１～２次，得到６株分泌抗绵羊肺炎支原体抗原的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞株．选择抗体分泌较高的１４Ａ６、７Ａ２７、Ｂ３８进行了较详细的研究，结果表明，其核内染色体数为９４～９６．抗体属性是：１株为ＩｇＧ２ａ、２株为ＩｇＧ１．用间接ＥＬＩＳＡ法对３株ＭｃＡｂ作符异性分析、该ＭｃＡｂ只特异地与绵羊肺炎支原体抗原发生反应，而不与猪肺炎支原体、山羊无乳症支原体抗原发生反应．将杂交瘤细胞注射ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠诱生腹水．其抗体效价提高１００倍．杂交瘤细胞在液氮中保存１～２年后复苏仍能稳定地分泌抗绵羊肺炎支原体ＭｃＡｂ。     

杆状病毒表达的兔出血症病毒衣壳蛋白的自我装配,抗原性及免疫原性

用杆状病毒系统表达了兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）衣壳蛋白。表达产物的分析表明，用抗ＲＨＤＶ抗体的ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ试验可证实６０ＫＤ重组蛋白的抗原性。细胞培养上清和纯化蛋白的直接电镜表明，在昆虫细胞表达的衣壳蛋白可自我装配形成空病毒样粒子（ＶＬＰ），其大小和形态与天然病毒类似。这些病毒粒子与抗ＲＨＤＶ的多克隆抗体以及四个识别病毒构象表位的单克隆抗体（ＭＡｂ）均有免疫反应性。表明ＶＬＰ     

抗独特型抗体对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的免疫作用

用PRRSV感染SPF猪，血清检测结果显示，机体不仅产生抗PRRSV抗原的各种抗体(Ab1)，而且产生针对这些抗体的抗独特型抗体(Ab2)。根据各种蛋白质的等电点不同，应用IEF技术分离纯化出PRRSV感染猪血清中的不同IgG。分别以纯化的抗PRRSV—GP5蛋白、抗PRRSV-M蛋白的Ab2免疫SPF猪各5头，7d后经鼻腔感染PRRSV，定期采集血样进行病毒分离或鉴定试验。抗PRRSV-GP5蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；3头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；2头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫的猪，其血样自感染后3～7d均检出PRRSV；2头猪在感染后14～63d未检出PRRSV；3头猪在感染后14～35d检出PRRSV，从42～56d转为阴性，其中1头猪在63d时检出PRRSV。抗PRRSV—GP5和抗PRRSV—M蛋白的Ab2免疫作用显著，可作为PRRSV-GP5和PRRSV—M蛋白的替代抗原产生具有中和效应的抗体，保护机体免受PRRSV的感染。     

抗A型产气荚膜梭菌单克隆抗体的研制和鉴定

本试验用NSo细胞和产气荚膜梭菌肠毒素免疫的BALB／C小鼠脾细胞融合，获得了2株能分泌抗A型产气荚膜梭菌肠毒索单克隆抗体的杂交瘤细胞。经鉴定．这2株杂交瘤细胞的平均染色体数目为96．8条，单抗亚类为IgG1，杂交瘤细胞培养上清及腹水单克隆抗体的效价均较高，而且与其他几种常见的毒素SE、LT、S—LT、产气荚膜梭菌α毒素等不存在交叉反应。1D5能完全中和NCTC8239、S020718所产生的CPE的生物学活性，而284的中和活性则较差。     

旋毛虫S_3抗原的提取及其抗独特型抗体制备

通过匀浆、差速离心等方法提取旋毛虫肌幼虫S3抗原,并对其进行了琼脂双向双扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、薄层等电聚焦电泳、肌幼虫孵化试验等免疫学和生化特性分析。以S3抗原免疫兔,再将其抗体免疫同种异体兔,经亲和层析共获得3株抗独特型抗体(R1、R2、R3)。固相放射免疫竞争抑制试验表明,随着抗独特型抗体浓度的升高,其对125I标记的S3抗原-兔Ab1系统及人Ab1系统抑制率均升高,其中R1株对以上两系统的最高抑制率分别达92%和68%。进而证实,3株抗独特型抗体可变区结构与旋毛虫肌幼虫S抗原的决定簇或其邻近结构是相似的,为种间交叉反应型抗独特型抗体。     

马立克氏病病毒抗独特型单克隆抗体的研究

应用纯化的D_(11)~4株抗马立克氏病病毒（MDV）中和性单克隆抗体（McAb_1）,以SPA-IgG法和脂质体-IgG法制成免疫原,分别免疫BALB/c小鼠,应用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合。以两步ELISA筛选法获得了3株抗独特型单克隆抗体（McAb_2）,分别命名为1B_8、10C_1和3D_5,其Ig亚类分别为IgG_1、IgG_1和IgG_(2b),染色体数在92～102之间。在捕获阻断ELISA中,McAb_2在1:20～1:80000稀释可不同程度地阻断MDV抗原与McAb_1的结合,阻断率为2.66％～76.40％。用纯化的McAb_2制成油佐剂苗,免疫20日龄雏鸡,经3次免疫后10d采取血清,可测得不同滴度的针对MDV抗原的抗体。这提示3株McAb_2的可变区构型和与McAb_1结合的MDV抗原决定簇或其邻近结构相似,有可能用于MD抗独特型疫苗的研究。     

赤羽病毒单克隆抗体的研制及鉴定

用纯化的赤羽病毒（akabane virus,AKAV）免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗赤羽病毒单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为AKAV McAb 3A株和2C株。ELISA试验和中和试验结果表明,本研究制备的2株McAb均具有良好的特异性,为AKAV阳性,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1∶640和1∶320,腹水的效价分别为1∶256000和1∶128000,亲和常数（Ka）分别为1.16×10^-9和6.31×10^-8 mol/L,3A株的相对亲和力大于2 C株,具有病毒中和活性,中和效价分别为1∶64和1∶32,其IgG亚类为IgG1,轻链的亚型均为kappa型,2株细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体,表明AKAV McAb制备成功,为赤羽病快速诊断方法的研究奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定

旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体，本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT，经IPTG诱导表达后，获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT，利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT，并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法，最适抗原包被浓度为0.625 μg·mL^-1，最适血清稀释度为1：6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合，采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体，分别命名为1G8、2C3和2G3，均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1：200、1：3 200和1：3 200。Western blot结果显示，3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应，而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达，对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定，结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是⁸³DQDWMDS⁸⁹、⁹⁰SNPGTW⁹⁵和¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³。本研究成功制备了3株抗cOmpT蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，为cOmpT蛋白功能研究和APEC新型表位疫苗研发奠定了基础。     

Development of Monoclonal Antibodies against the cOmpT Protein of Avian Pathogenic Escherichia coli and Identification of Epitopes Recognized by Monoclonal Antibodies

To development monoclonal antibodies against cOmpT of avian pathogenic Escherichia coli (APEC), the recombinant cOmpT of APEC origin expression plasmid pET-28a-compT was employed, and cOmpT protein with a molecular weight about 36 kD in the form of inclusion bodies was obtained after induction with IPTG, and then renatured by urea gradient dialysis. BALB/c mice were immunized with the purified cOmpT. An indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA) was developed, the optimal coating concentration of the antigen was 0.625 μg·mL^-1 and the optimal serum dilution was 1:6 400. After the fourth immunization, the spleen of immunized mice was collected for cell fusion, three monoclonal hybridomas that can secrete antibody specific to cOmpT were obtained after multiple screenings, named 1G8, 2C3 and 2G3 respectively. And all of their immunoglobulin subclasses were IgG2b. The titers of monoclonal antibodies in the cell culture supernatant were 1:200, 1:3 200 and 1:3 200 determined by iELISA, respectively. All three monoclonal antibodies were confirmed to react with cOmpT in Western blot, without cross reaction with other tested bacteria. The antigenic epitopes recognized by the three monoclonal antibodies were identified by using a series of E. coli strains harboring expression plasmids recombined with truncated fragments from compT gene. The results revealed that the antigenic epitope required for reactivity with the 1G8 was ⁸³DQDWMDS⁸⁹, and ⁹⁰SNPGTW⁹⁵, ¹⁹⁷TFKYSGW²⁰³were recognized by 2C3 and 2G3, respectively. In this study, three monoclonal antibodies against cOmpT were successfully developed and the antigenic epitopes recognized by the antibodies were identified. The cOmpT specific monoclonal antibodies obtained in this study are potentially useful tools for both the functional study of cOmpT and the development of APEC epitope vaccines.     

基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化

以重组兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白为抗原，建立了RHDV抗体间接ELISA检测方法。优化的试验反应务件为：重组VP60的包被质量浓度为1．0mg／L，用10％牛血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的ELISA与现行血凝抑制(HI)试验比较发现，不同免疫状态的兔血清的RHDV ELISA抗体与HI抗体均呈正相关。对11个RHD免疫兔场1130份血清样品的抗体检测表明，各免疫兔群血清RHDV抗体水平不完全一致，D值在1．09～1．76之间，显著高于非免疫兔(0．05)及SPF兔(0．02)，低于高免兔(2．34)。在此基础上，研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒，测定了其主要指标，制定了各成分的质量控制标准，为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。     

狂犬病病毒糖蛋白单克隆抗体的制备

用狂犬病病毒BD06株脑毒免疫BALB/c小鼠,制备G蛋白单克隆抗体。将灭活的BD06脑毒免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,通过间接ELISA法和荧光抗体病毒中和试验法进行4轮筛选,获得6F12、1B12共2株具有中和活性的糖蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blotting分析和直接免疫荧光检测结果显示,获得一株针对狂犬病病毒糖蛋白构象表位的单抗6F12和一株针对糖蛋白线性表位的单抗1B12。小鼠中和试验结果显示,两株杂交瘤细胞分泌的抗体均具有狂犬病病毒中和活性。结果表明,获得了两株针对狂犬病病毒G蛋白不同抗原表位的中和活性单克隆抗体,为狂犬病病毒特性研究和检测奠定了基础。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为表达猪瘟病毒E0蛋白并制备其多克隆抗体,本研究构建E0蛋白的原核表达载体,转化至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导表达,亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot分析显示E0重组蛋白主要以包涵体形式表达,亲和层析纯化获得了E0重组蛋白,用其免疫Balb/c小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。间接ELISA显示,免疫小鼠血清中E0蛋白抗体效价为1∶50 000。获得的E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及E0-EGFP融合表达细胞中天然结构的E0蛋白发生特异性反应。本研究制备的E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。