反义RNA介导GmFAD2-1B基因沉默增强大豆种子中油酸的高效累积

油酸含量是评价大豆油食用品质和稳定性的重要指标。本研究采用农杆菌介导转化法,将反义GmFAD2-1B基因导入栽培大豆品种,获得油酸含量显著提高的转基因大豆新品系。Southern杂交检测表明,外源GmFAD2-1B基因片段已导入大豆基因组,其插入拷贝数为1~5个。q RT-PCR检测表明,外源GmFAD2-1B主要在大豆种子中表达,并导致种子中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平显著降低,而根、茎、叶、花组织中内源GmFAD2-1 m RNA表达水平无显著变化。脂肪酸组分分析表明,12份转基因大豆种子油酸含量为27.38%~80.42%,其中,L40和L72油酸含量分别为68.91%~80.42%和65.98%~80.22%,较对照品种Williams 82(17.8%~22.0%)提高2.65倍以上,亚油酸降低至4.84%~14.55%,饱和脂肪酸降低至10.34%~11.16%,但总脂肪和总蛋白含量与对照品种相比没有显著变化。农艺性状分析表明,转基因大豆在熟期、株高、叶形、花色、结荚高度、百粒重等方面与对照品种也没有显著差异。     

我国主栽棉花品种的棉籽油资源评价与分析

【目的】探讨不同地区、不同棉花品种棉籽油脂肪酸含量与组成的差异。【方法】以收集于我国棉花主产区的82份棉花品种的棉籽为试验材料,采用索氏法提取种子中粗脂肪,并利用气相色谱法分析脂肪酸组成和含量,最后通过聚类分析等分析脂肪酸组成与棉花品种和产地之间的内在联系。【结果】棉籽仁脂肪总含量在188.4~302.8 mg·g~(-1),平均为249.52 mg·g~(-1)。棉籽仁中主要脂肪酸为亚油酸(104.88~180.68 mg·g~(-1))、棕榈酸(41.53~69.77 mg·g~(-1))、油酸(28.29~48.86 mg·g~(-1))和硬脂酸(3.56~6.8 mg·g~(-1));各品种脂肪酸含量具有差异。聚类分析表明,棉籽脂肪酸总含量和脂肪酸组成与产地具有相关性。【结论】本研究筛选得到棉籽脂肪酸总含量以及油酸、亚油酸、亚麻酸高的材料,明确了82份种质资源的棉籽油分特征、特性和利用价值。     

EPSPS外源基因对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响

以G6-1至G6-19等19个转基因抗草甘膦除草剂棉花种质为材料,以其非转基因背景亲本中棉所49为对照,研究EPSPS外源基因导入对陆地棉农艺性状和纤维品质的影响,结果表明外源基因的导入对棉花纤维上半部平均长度、马克隆值、断裂伸长率和断裂比强度等品质性状有显著影响;对于棉花衣分和铃重等农艺性状亦有显著的影响,衣分变异范围为30.5%~42.7%,T1和T2相关性分析表明衣分的变异为可遗传性变异,铃重最高为6.5 g,最低为4.6 g,两者相差40%。因此,转基因棉花育种研究不仅要注重目标性状的转育,还要注重非目标性状的筛选。     

棉花FAD 2-1基因的克隆及其ihpRNA和amiRNA干扰载体的构建

 采用RT-PCR方法克隆了棉花△-12脂肪酸去饱和酶基因(GhFAD2-1)的cDNA全长序列,该基因含有1158 bp的完整开放阅读框。棉花FAD2-1是种子中编码催化油酸形成不饱和脂肪酸的关键酶的基因,选取GhFAD2-1基因中的一段特异的515 bp片段,构建了种子特异性启动子NAPIN调控的ihpRNA干扰表达载体pFGC1008-NAPIN-FAD2-1,同时构建了针对GhFAD2-1基因的人工miRNA表达载体pCAMBIA1302- amiRNA-FAD2-1。     

利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系

大豆是重要的油料作物,其种子脂肪酸中油酸含量是评价大豆油脂品质的重要指标之一。本研究设计了分别由AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑GmFAD2-1A基因的外显子区,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-DB载体上,然后利用农杆菌介导的方法转化大豆材料华夏3号。通过PCR技术及测序分析对T1代转基因大豆植株靶点编辑情况进行检测,获得纯合GmFAD2-1A大豆突变体。GmFAD2-1A突变大豆植株在株高、主茎节数、单枝分枝数、叶形、花色、种皮色、种脐色、生育期等方面与对照大豆植株没有显著差异;而GmFAD2-1A突变体大豆种子油酸含量显著高于对照大豆品种华夏3号,说明GmFAD2-1A是油酸代谢过程中的关键基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功对控制大豆油酸基因GmFAD2-1A进行编辑,获得稳定的纯合GmFAD2-1A大豆突变体材料,为高油酸育种提供了新的种质资源并创建了方法。     

棉花4个脂肪酸合成相关基因的克隆和表达特征分析

脂肪酸合成相关代谢在控制油的合成和抗非生物胁迫中均起着重要作用。其脂肪酸合成相关基因的时空表达水平直接影响油的含量和脂肪酸合成相关酶的活性。本研究克隆了4个脂肪酸合成相关基因,分别命名为GhKASII、GhKASIII、GhFAD和GhGPAT,其中GhKASIII、GhFAD和GhGPAT基因cDNA全长通过电子克隆和同源克隆得到。而GhKASII通过筛库和5'-RACE途径得到。组织表达分析表明, 上述4个基因在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,属于组成性表达基因。其中GhKASII、GhKASIII在25 DPA种子中表达量最高,GhGPAT在0 DPA胚珠和15 DPA纤维中表达量很高,GhFAD在0DPA胚珠, 15 DPA种子,20 DPA纤维中表达量均很高。不同非生物胁迫的诱导表达分析表明,上述4个基因均不同程度被茉莉酸甲酯,ABA,创伤和冷害等逆境诱导表达。     

Effects of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and tissue culture on storage lipids in Brassica napus

The variation obtained in storage fatty acids induced by the procedures of tissue culture and transformation with Agrobacterium tumefaciens was investigated and compared in rapeseed, Brassica napus, cv. Hanna. An increased variation in the fatty acid profiles was noted after tissue culture and transformation compared with plants derived directly from seeds. In the second generation of rapeseed transformants, T₂, the content of oleic acid ranged from 39–72%, 12–31% for linoleic acid and 7–16% for linolenic acid. This could be compared with the oleic acid content in the T₂ generation of tissue culture-derived plants which ranged between 47–76% and in seed-derived material where oleic acid ranged between 55–69%.In the T₃ generation the ranges in transgenic seeds were decreased but still larger than in the seed derived plants. The range in transgenic plants was 49–64% for oleic acid, 20–28% for linoleic acid and 9–18% for linolenic acid. The most extreme individuals, both highest and lowest in the common fatty acids, were found in the group of transformed plants independent of generation. The total lipid content was also affected by the two treatments and seeds with the lowest and highest lipid content were both found among the transformed plants. In conclusion, care should be taken to use proper controls when performing transformation experiments in order to distinguish variation in the fatty acid profiles induced by the transformation procedure and tissue culture treatments from the changes due to transgenic expression. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

大豆脂肪酸组分的胚、细胞质和母体遗传效应分析

利用5个大豆品种配制20个杂交组合,采用广义种子遗传模型分析了大豆脂肪酸组分的胚、细胞质和母体植株等3套遗传体系的基因主效应和基因型×环境效应。棕榈酸含量、硬脂酸含量和亚油酸含量是以基因型×环境互作效应为主。亚麻酸和油酸的遗传主效应和基因型×环境互作效应相近。在脂肪酸组分的遗传主效应中,棕榈酸、硬脂酸和亚油酸含量是以胚主效应为主。油酸含量和亚麻酸含量以细胞质主效应为主。在基因型×环境互作方差中,脂肪酸组分以极显著的胚互作方差为主。亚麻酸含量是以基因的加性效应和加性×环境互作效应为主,棕榈酸含量、硬脂酸含量、油酸含量和亚油酸含量以基因的显性和显性×环境互作效应为主。棕榈酸含量和油酸含量是以普通狭义遗传率为主。硬脂酸、亚油酸含量和亚麻酸含量以互作狭义遗传率为主。在普通狭义遗传率中,棕榈酸含量、油酸含量和亚麻酸含量以细胞质普通遗传率和母体普通遗传率为主。在互作狭义遗传率中,油酸含量和亚麻酸含量以胚互作狭义遗传率为主,亚油酸含量以母体植株互作遗传率为主。棕榈酸含量、硬脂酸含量、油酸含量和亚油酸含量以细胞质及母体选择响应和互作选择响应为主,亚麻酸含量的胚普通选择响应和互作选择响应为主。     

花生品种主要脂肪酸含量在不同生态区的稳定性

花生是主要的油料作物,脂肪酸组成受环境等的影响而不稳定。本研究选取60份黄淮及长江流域产区主推的花生品种,连续2年在湖北武汉、河北石家庄、河南濮阳和河南周口4个环境下种植,利用GB/T5510-2011法检测种子脂肪酸含量。结果表明,高油酸花生品种油酸含量比普通油酸品种稳定,普通油酸品种棕榈酸和亚油酸含量比高油酸品种稳定;武汉种植环境有利于花生油酸含量的提高,2年60份品种的平均油酸含量均最高,分别为52.93%和52.64%;高油酸花生品种除油酸含量显著提高外,花生烯酸含量也提高了54.1%;而棕榈酸和亚油酸含量分别降低了45.20%和90.44%。结合前期SSR研究结果,本研究涉及的6份高油酸品种属于不同的类群(G1、G2c和G2e),其遗传背景差异较大。本研究结果为花生品种的合理布局和进一步的遗传改良提供了理论依据。     

大豆籽粒发育过程中脂肪酸组分的累积动态

在大豆籽粒形成过程中,随着棕榈酸、亚麻酸的含量下降,硬脂酸、油酸和亚油酸含量上升。在棕榈酸累积的中、后期,高蛋白品种与其他品质类型品种有一定差异。油酸的累积主要在大豆籽粒形成的早期,但高油品种红丰9号与其他5个品种有较大差异。亚油酸的累积则主要在中后期。开花后51 d是这5种脂肪酸累积的共同转折点。     

棉花脂肪酸合成酶基因GhKAR和GhENR表达载体构建及其功能初探

酮脂酰ACP还原酶(β-ketoacyl-(ACP)reductase,KAR)和烯脂酰ACP还原酶(β-enoyl-(ACP)reductase,ENR)是脂肪酸合成过程中2个关键的还原酶,主要负责脂肪酸碳链的延伸。为明确棉花同源基因的功能,克隆了陆地棉Gh KAR和Gh ENR基因,并构建表达载体;应用花粉管通道法转化棉花,经过PCR检测和Southern杂交,筛选出阳性单拷贝植株,分析其后代株系中目的基因对油分含量以及抗寒性的影响。通过对转基因T4株系含油量的测定,发现转基因株系种子的含油量比野生型对照提高10.2%~14.1%,与对照差异极显著。通过气相色谱法分析转基因株系种子的脂肪酸成分,发现不饱和脂肪酸含量比野生型对照增加4.04%~6.02%。测定4℃低温胁迫下各个转基因株系不同时间生理指标的变化,结果表明:转基因株系的相对电导率和脯氨酸含量积累明显高于对照,而丙二醛含量低于对照,在不同胁迫时间与对照表现出显著或极显著差异,过表达的转基因株系的抗寒性有所提高。     

花生种子发育过程中脂肪酸积累规律的研究

以鲁花14为材料,对花生种子发育过程中荚果和种子的发育情况以及花生种子脂肪酸的累积过程进行了研究。结果表明,在果针入土的第39天,小种子(远离果针一端)的平均长度超过大种子(靠近果针一端),在接近成熟时,小种子的平均质量超过大种子。在花生种子中,可以检测到12种脂肪酸。按含量由高到低依次为油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、山萮酸、花生酸、二十四烷酸、花生烯酸、异油酸、亚麻酸、棕榈油酸、豆蔻酸。在花生种子发育过程中,脂肪酸含量随种子的发育逐渐增加,油酸含量不断增多,而亚油酸则呈缓慢减少的趋势。在接近成熟时,油酸和亚油酸占全部脂肪酸含量的79.4%。油酸亚油酸的比值随着种子的发育呈逐渐增大的变化规律。     

单粒花生主要脂肪酸含量近红外预测模型的建立及其应用

脂肪酸组成是影响花生营养价值和货架寿命的主要因素,高油酸花生以其营养保健价值高、化学稳定性好、耐储藏等特点,深受广大消费者和花生加工企业的喜爱。因此,培育高油酸品种是花生育种的重要目标,建立快速、高效、准确检测花生中主要脂肪酸含量的无损方法是加快花生脂肪酸改良和高油酸品种选育进程的重要技术保障。本研究利用近红外光谱技术建立了可以非破坏性地快速检测单粒花生中油酸、亚油酸、棕榈酸含量的数学模型,其中油酸模型的决定系数(R2)为0.907,均方差为3.463;亚油酸模型的决定系数为0.918,均方差为2.824;棕榈酸模型的决定系数为0.824,均方差为0.782。使用100粒花生验证该模型的准确性,结果油酸、亚油酸和棕榈酸的近红外预测值与化学值的相关系数分别为0.88、0.90和0.71,表明此模型可以准确地预测单粒花生中这3种脂肪酸的含量。本研究借助该模型建立了一种不依赖分子标记的快速、高效选育高油酸花生的方法,并成功应用于高油酸花生育种,选育出高油酸花生品种中花215。     

转Rs-AFP2基因小麦的分子分析及其纹枯病抗性

Rs-AFP2属于r-硫堇类抗菌肽,主要通过形成离子通道直接破坏细胞来杀灭病原菌。本研究通过基因枪介导法结合对目标基因的分子检测,证明已将外源Rs-AFP2基因转入小麦推广品种扬麦12中。通过逐株抗纹枯病接种鉴定、PCR、PCR-Southern blot、Southern blot和 RT-PCR/荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析,对转Rs-AFP2基因小麦T₁至T₄代植株跟踪检测。结果表明,Rs-AFP2在转基因小麦中能够稳定遗传,以单拷贝整合到小麦基因组中,遗传方式符合孟德尔遗传规律,并能在转录水平上表达。对转Rs-AFP2基因小麦的抗病性、主要农艺性状以及Rs-AFP2表达活性分析结果表明,与受体扬麦12相比,Rs-AFP2表达活性高的转基因小麦植株对纹枯病抗性有明显提高,其抗病性可以遗传,而主要农艺性状没有明显差异,证明可以利用Rs-AFP2基因和基因工程途径创制抗纹枯病小麦新种质。     

利用回交法快速选育高油酸花生新品系

以普通花生品种花育22为母本、高油酸花生品种开农176为父本杂交得到F1杂种,筛选油酸含量高于60%且同时含有FAD2a和FAD2b位点的F1为杂交父本,以花育22为轮回亲本(母本)连续回交得到BC1F1~BC4F1代回交种。利用近红外光谱仪测定F1及BC1F1~BC4F1籽粒的油酸、亚油酸含量,选择油酸含量大于60%的种子,用刀片切取种子小部分子叶提取DNA,以F0.7/R3为引物进行PCR扩增及测序,根据测序峰图差异表现筛选出同时含有FAD2a和FAD2b位点的种子作为下一代回交的父本。切去部分子叶的种子切口用石蜡封闭,播种前浸泡于40℃温水中催芽,对12 h后未露白的种子用100 mg L–1乙烯利浸泡4 h后再转入40℃温水浸泡至24 h,发芽率可达到98%。2013年春季开始杂交,2016年春在青岛播种BC4F2代种子,取幼苗期幼叶鉴定基因型,筛选出基因型为aabb的单株,收获时选留农艺性状类似于花育22的优良单株,再利用近红外光谱仪测定所选单株油酸含量,获得油酸含量在70%以上、油酸亚油酸比值大于7.0的单株24个。这些单株与花育22相比,农艺性状基本相同,称为改良花育22高油酸花生新品系。     

棉籽油分和3种主要脂肪酸含量QTL分析

本研究对棉籽油分、棕榈酸、油酸和亚油酸含量进行了不同遗传体系的QTL分析,为相关性状挖掘出更多有用的基因信息。分别于2017年和2018年,利用陆地棉亲本HS46 (P₁)和MARCABUCAG8US-1-88 (P2)所构建的188个重组近交系分别与双亲杂交构建F1群体BC (P₁)和BC(P₂)。基于这些回交群体种子,采用专为种子性状设计的母体和胚核基因组QTL定位的混合线性遗传模型及QTLNetwork-CL-2.0-Seed软件,对棉籽油分、棕榈酸、油酸和亚油酸含量进行QTL定位分析。共检测到7个控制棉籽油分含量、3个控制棕榈酸含量、2个控制油酸含量和3个控制亚油酸含量的QTL,均具有显著或极显著的源自母体和胚2个核基因组的加性主效应,其中有7个QTL的表型变异贡献率大于10%。研究结果可为这些性状的分子标记辅助选择育种提供更为可靠的参考,为这些性状的分子遗传机制研究提供理论基础。     

甘蓝型油菜油酸脱氢酶基因(fad2)多个拷贝的发现及分析

以甘蓝型油菜湘油15为材料, 随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA克隆和9个授粉27 d后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91.0%~99.9%, 从中得到11个差异序列, 即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现, 6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子, 另外5个的同源性为90.60%~99.74%, 与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较, 发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA, 它们的编码区中没有终止密码子, 说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组, 命名为fad2I和fad2II。RT-PCR分析发现在授粉27 d的种子中fad2I有较强表达, fad2II没有表达; 但在叶片中两者都有表达。     

Generation and Glyphosate Resistance Analysis of G10eve Transgenic Cotton

[Objective] Novel germplasm of cotton was generated for development of cultivars with high resistance to glyphosate. [Method] The glyphosate resistance gene G10eve was preliminarily analyzed using bioinformatics methods and introduced into 'Coker 312' via Agrobacterium-mediated transformation. The expression of G10eve was estimated by PCR (Polymerase chain reaction) and qRT-PCR (Quantitative real-time PCR). The content of shikimic acid and tolerance to glyphosate were determined in response to application of glyphosate to 'Coker 312' and transgenic plants. [Result] A total of 28 independent positive transgenic lines were obtained. The transformation efficiency and the rate of seedling differentiation were up to 49.3% and 40.6%, respectively. PCR and qRT-PCR analysis showed that G10eve was integrated into the cotton genome, and the G10eve expression level differed significantly among the transgenic lines. At the cotyledon stage, the transgenic cotton showed resistance to 8 mL·L^－1 glyphosate, whereas 'Coker 312' showed phytotoxicity to the 2 mL·L^－1 glyphosate treatment. No significant accumulation of shikimic acid was detected in transgenic plants before or after glyphosate treatment, which indicated the typical physical characteristic of glyphosate resistance. [Conclusion] Overexpression of G10eve in cotton improved resistance to glyphosate. Thus, novel germplasm of cotton resistant to glyphosate was generated.     

Analysis on Competitive Heterosis of Hybrid F1 and F2 between Transgenic Bt Varieties of Upland Cotton

[Objective] The purpose of this study is to supply basis for selecting strong heterosis hybrid and the feasibility of F₂ utilization, by evaluating yield heterosis and fiber quality traits of hybrid F₁ and F₂ generated by transgenic Bt varieties in upland cotton. [Method] Ten upland cotton varieties (lines) with good comprehensive characteristics were selected to produce 10 crosses, and four of them with better competitive heterosis (CH) in yield were screened out to analyze the lint yield and fiber traits of F₁ and F₂. [Result] The results indicated there was a strong CH in yield of F₁, but the yearly variation was large. Hybrids performed better in the poor production year. The CH in yield decreased obviously in most of the F₂ combinations. Further analysis showed that the decrease of boll weight was the main cause of drop of yield CH in F₂. The fiber quality index in F₂ showed a downward trend compared with F₁, and the coefficient of range and variation(CV) increased. The coefficient of variation of quality traits was much lower than that of yield components, with a trend of F₁ < SCRC 28 (CK) and F₂ > F₁. The CH of lint yield and fiber traits changed between F₁ and F₂ in different combinations. We screened out a combination with higher CH of yield in both F₁ and F₂, and with less decreased yield CH, fine fiber quality and light separation in F₂. [Conclusion] The hybrids generated by transgenic Bt varieties in upland cotton characterized by strong adversity resistance and yield stability. Fine fiber quality and light separation in F₂ came from crosses with the parents of fine fiber quality and small differences. So, it is possible for breedersto select valuable F₂ combinations in production.