蛋白质定向进化的高通量筛选方法

定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。     

酶的定向进化及其应用进展

酶的定向进化是用于改良酶特性的一种策略,主要包括构建酶突变文库和高通量筛选。目前,突变文库的构建手段主要有随机突变、半理性设计和DNA改组;高通量筛选方法主要分为体内筛选和体外筛选。该文介绍易错PCR、半理性设计、DNA改组、表面展示、核糖体展示和差示荧光扫描等相关技术及其应用情况。     

鸡源沙门氏菌对β-内酰胺类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

[目的]从沙门氏菌全基因组范围筛选和鉴定其与β-内酰胺类抗生素耐药性相关的基因.[方法]对临床分离的10株沙门氏菌进行药敏试验,选择耐药性最广泛的菌株作为研究对象,利用mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,筛选文库中对β-内酰胺类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变体中转座子的插入位点及其破坏的基因.[结果]从突变株文库中筛选得到15株分别对青霉素G、氨苄西林和头孢哌酮敏感的突变株,其中3株对三种抗生素都敏感.转座子破坏基因为STM4216 (inner membrane protein)和STM4150 (50S ribosomal protein L1).[结论]筛选出的基因有望成为控制或扭转沙门氏菌耐药性的作用靶点.     

应用宏基因组技术从微生物中获得活性物质的研究进展

采用传统培养的筛选方法,地球上99%以上的微生物还没能被人类开发生产活性物质,这使得自然界中微生物资源的开发利用受到极大限制。宏基因组文库技术的应用避开了微生物纯培养的问题,极大拓展了微生物资源的利用空间,目前被广泛应用于各种新的酶及活性物质的研究。在重点介绍宏基因组文库的构建及筛选方法等,以及宏基因组技术在微生物活性物质筛选中应用的基础上,对宏基因组研究存在的问题进行了探讨。     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的构建及群体感应信号分子突变株的筛选

利用三亲杂交的方法将带卡那抗性的Mini-Tn5转座子随机插入瓜类细菌性果斑病菌xjl12基因组DNA中,构建插入不同位点的突变体文库,通过信号分子高效检测菌株JZAI,筛选群体感应信号分子失活突变株.挑取2株野生株和筛选出的4株突变株,进行Southern杂交,结果表明,转座子Mini-Tn5以单拷贝随机诱变瓜类细菌性果斑病菌获得成功;对筛出的4株突变株进行了致病性和烟草过敏反应测试,发现突变株明显降低了致病性,且2株突变株(5-17,2-57)在烟草上无过敏反应.瓜类细菌性果斑病菌突变体文库的成功构建及筛选到不同突变位点的群体感应信号分子失活突变株,对从基因水平研究瓜类细菌性果斑病菌致病分子机理及群体感应相关基因奠定了基础.     

牛源大肠杆菌对喹诺酮类抗生素耐药相关基因的筛选及鉴定

为在大肠杆菌全基因组范围内筛选和鉴定与喹诺酮类抗生素耐药性相关的基因,通过对临床分离的13株大肠杆菌进行药敏试验,选择耐药谱较广泛的菌株作为研究对象,利用Mariner转座子对其基因组进行随机突变,获得转座子突变株文库,并以亲本菌株为对照筛选文库中对喹诺酮类抗生素敏感的突变体,通过套式PCR、核苷酸测序及序列比对确定突变株中转座子的插入位点及其破坏的基因。结果表明:从突变株文库中筛选得到22株分别对诺氟沙星、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸敏感的突变株,其中7株对4种抗生素都敏感;插入位点分析发现,抗生素敏感突变株中被转座子破坏的基因包括ecs4206(磷酸核酮糖激酶)、ecs3959(β-D-半乳糖苷酶β亚基)、ecs3946(假定蛋白)和ecs1857(DNA结合转录调控因子)。筛选出的基因可被开发为控制或扭转大肠杆菌耐药性的作用靶点。     

宏基因组技术在筛选未培养微生物中新型酶的研究进展

介绍了宏基因组文库的构建及酶基因的筛选方法,对瘤胃、土壤及其他环境中微生物宏基因组文库的构建和酶基因的筛选研究进行了综述,同时就宏基因组技术在未培养微生物研究中的应用进行了展望。     

解淀粉芽孢杆菌Bs-18生防功能相关基因的初步鉴定

本研究利用平板筛选法,从转座子TnYLB-1转化的解淀粉芽孢杆菌Bs-18的突变体文库中筛选到生防作用发生明显变化的3株突变株。以这3株突变株为材料,通过反向PCR技术对突变体中转座子插入位点的侧翼序列进行BLAST比对分析,发现它们与野生芽孢杆菌的芽孢形成、细胞分离、细胞的一系列代谢活动等有关。     

植物体细胞耐盐突变体的研究进展

植物体细胞耐盐突变体研究已经成为抗盐植物育种学研究的热点问题.综述了植物耐盐体细胞突变体筛选的试材确定、突变体筛选方法和突变体鉴定的研究现状,并指出植物耐盐突变体筛选还存在着变异类型复杂,变异方向难以控制,耐盐细胞系难以再生植株等缺陷.应加强高效稳定的植株再生体系建立;加强细胞悬浮培养技术研究,提高耐盐突变体筛选效率;提高耐盐目标性状的变异频率,减少非目的性状变异产生;从不同层面上加强耐盐突变体基础研究,提高突变体检测效果等方面研究,以提高植物体细胞耐盐突变体育种效果,更好地为实践和生产应用.参36     

纤维素酶活性改良的研究进展

纤维素酶对纤维素高效水解起重要作用,但目前的纤维素酶存在活性不高、对天然木质纤维素分解能力弱等因素限制其推广和应用等问题。本文对各种改良纤维素酶活性的方法进行总结,例如利用纤维素酶和底物性质、定向诱导、直接进化、化学物理诱变育种等方法实现纤维素酶性质的改良。对每种方法的优缺点进行比较分析,其中定向诱变技术提高酶活上,获得所需的功能酶都需要耗费大量的时间和精力,而利用直接进化的方法,不需要了解蛋白质结构和酶与底物之间的关系就能够成功筛选高活性的酶,此外,根据目标酶的性质和底物的特性进行筛选也具有其独特的优势。     

EMS诱变六倍体小麦偃展4110的形态突变体鉴定与分析

 【目的】构建小麦EMS突变体库,为小麦功能基因组学研究准备基础材料。【方法】利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变处理小麦品种偃展4110种子,将获得的M2代材料进行生物学性状与农艺性状鉴定,部分M3材料播种家系进行验证。【结果】对M2代全生育期田间表型进行观察鉴定,突变群体的表型变异率约为6.6%;获得了幼苗、叶、茎、穗及成熟期等生物学特性与主要农艺性状的变异体和突变体,变异类型丰富,特别是发现了自然突变中少见的变异类型,如株高在10-15 cm左右的特矮变异类型。【结论】本研究所构建的两个偃展4110 EMS突变群体较为理想,可望有效地被用于小麦功能基因组研究和小麦遗传改良中。     

T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库的构建

为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%~2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨基酸突变改变了T7噬菌体吸附宿主的能力。本研究成功构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,验证了loop区域在T7噬菌体识别宿主过程的作用,为后续筛选有益噬菌体开发抗菌产品提供支撑。     

Positional syntenic cloning and functional characterization of the mammalian circadian mutation tau

The tau mutation is a semidominant autosomal allele that dramatically shortens period length of circadian rhythms in Syrian hamsters. We report the molecular identification of the tau locus using genetically directed representational difference analysis to define a region of conserved synteny in hamsters with both the mouse and human genomes. The tau locus is encoded by casein kinase I epsilon (CKIepsilon), a homolog of the Drosophila circadian gene double-time. In vitro expression and functional studies of wild-type and tau mutant CKIepsilon enzyme reveal that the mutant enzyme has a markedly reduced maximal velocity and autophosphorylation state. In addition, in vitro CKIepsilon can interact with mammalian PERIOD proteins, and the mutant enzyme is deficient in its ability to phosphorylate PERIOD. We conclude that tau is an allele of hamster CKIepsilon and propose a mechanism by which the mutation leads to the observed aberrant circadian phenotype in mutant animals.     

浅谈数字图书馆建设

介绍了数字图书馆的概念、发展现状和演变范式,并以中国矿业大学图书馆数字图书馆建设为例来说明我国数字图书馆的发展应该自我定位,明确未来的发展方向,才能缩短与国外的差距。     

智慧图书馆时代公共图书馆服务能力构建与提升路径研究

[目的/意义]当前智慧图书馆建设备受关注,以公共图书馆服务能力为研究对象,探讨公共图书馆服务能力构建及提升路径,以期为公共图书馆智慧化转型提供一定的指导。[方法/过程]通过文献研究法对公共图书馆服务发展的三阶段演化进行阐述,对智慧图书馆时代公共图书馆服务能力的概念、特征、需求重新审视,立足现有标准体系,结合时代发展需求,通过对公共图书馆服务能力构成要素、影响因素等基础理论的探析,构建服务能力体系。[结果/结论]公共图书馆服务能力的提升应当基于其要素结构,科学合理地阶段式推进。因此,智慧图书馆时代公共图书馆可从资源体系、馆员能力、组织文化、管理模式、合作环境5个维度提升服务能力,助推公共图书馆事业的发展。     

构建和谐图书馆刍议

对和谐图书馆的产生背景及基本内涵进行了浅释,分析了图书馆在发展过程中遇到一些“不和谐”的现状,并提出构建和谐图书馆的建议和措施。     

复合诱变选育腈水合酶高产菌株

[目的]选择有效的方法选育稳定的腈水合酶高产菌株。[方法]以Rhodococcus sp．HUST为出发菌株,采用紫外线和硫酸二乙酯对其进行复合诱变处理,选育出酶活力高的突变株进行培养并测定腈水合酶活性。[结果]菌株HUST复合诱变的条件为：出发菌株在距离为15cm时紫外诱变45s后再经1．1％的硫酸二乙酯诱变处理20min,然后进行有利突变株的筛选,通过初筛、复筛和遗传稳定性试验,获得1株遗传性状稳定的腈水合酶高产菌株HUST-1,其酶活高达698．6U,比诱变前提高了68．3％。[结论]通过紫外线和硫酸二乙酯复合诱变能选育出有较高腈水合酶活力的菌株。     

cDNA文库构建策略及其在盐生植物中的应用

构建各种cDNA文库是目前发现新基因的基本策略,同时也是功能基因组学研究的一个主要方法.cDNA文库主要包括cDNA全长文库、cDNA差减文库和cDNA均一化文库等类型,各种文库的原理、构建方法和适用范围都有很大的不同.近年来,通过构建各种cDNA文库、获得大规模高质量EST数据库,并在此基础上分离克隆抗逆相关基因已经成为研究植物耐盐机理的重要途径.旨在对cDNA文库的主要类型及其构建策略,以及cDNA文库在盐生植物新基因筛选中的应用进行综合论述,并对植物耐盐机制的研究提出了展望.