微小隐孢子虫类钙调蛋白基因的克隆与原核表达

为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。     

水貂犬瘟热病毒受体SLAM的原核表达

为了获得犬瘟热病毒受体信号淋巴激活分子(SLAM)蛋白,本试验以pMD18-T-SLAM为模板,应用PCR方法扩增得到水貂SLAM基因,将SLAM基因连接到经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切处理后的pGEX-6p-1原核表达载体中,获得重组质粒pGEX-6p-1-SLAM,转化至大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果表明,目的基因插入位置和阅读框正确,经诱导成功表达出分子质量约为63.2ku的SLAM-GST融合蛋白,该融合蛋白能与鼠抗GST标签单克隆抗体发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因原核表达载体的构建及其表达

经PCR从含有APXⅡA基因片段的重组质粒pT—APXⅡA中扩增出了APXⅡA基因。同时对目的基因和表达质粒pGEX-4T-1进行了双酶切，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析，证明连接向位和阅读框架正确。成功构建了APXⅡA基因的原核表达载体pGEX—APXⅡA。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS—PAGE分析表达目的蛋白。结果表明，蛋白质的分子质量为102．5ku。     

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。     

结核分支杆菌Rv3117基因的克隆与原核表达

以结核分支杆菌H37Rv株染色体DNA为模板,应用Rv3117基因特异性引物对该基因进行PCR扩增,获得约800bp的DNA片段。将PCR纯化产物克隆至pMD-18T Vector中,构建出重组质粒pMD-18T-Rv3117。以EcoRⅠ和SamⅠ双酶切pMD-18T-Rv3117重组载体和pGEX-4T-1原核表达载体,并将纯化的Rv3117基因亚克隆至pGEX-4T-1中,构建出原核重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3117。将pGEX-4T-1-Rv3117重组质粒转化至感受态E.coli BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约30ku目的蛋白带。Western blot分析结果显示,该蛋白能与抗结核分支杆菌阳性血清发生特异性反应。研究结果为结核病临床诊断抗原的筛选奠定了基础。     

南非Ⅱ型口蹄疫主要抗原表位串联基因的表达及抗原性分析

在对南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原分析基础上,将已经筛选出的6条抗原性良好的多肽采用柔性linker拼接,人工合成相应核苷酸后连入T载体中。将酶切回收的串联基因(VP1-VP3)克隆于表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-VP1-VP3。该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3) plysS中,经IPTG诱导后进行了可溶性分析和Western blotting分析,且对融合蛋白柱上酶切纯化后进行了抗原性分析。重组质粒pGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明,VP1-VP3串联基因已成功插入pGEX-6p-1载体中;pGEX-VP1-VP3融合蛋白分子质量约为38.3 ku,并以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该融合蛋白与南非Ⅱ型FMDV阳性血清能发生特异性反应;酶切纯化后蛋白间接ELISA鉴定结果表明,表达的VP1-VP3蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。串联多肽的成功表达,将为南非型口蹄疫血清学检测方法建立奠定基础。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的构建

用PCR从含产气荚膜松菌β毒素基因的质粒pXETB2中扩增出β毒素基因，NcoⅠ和BamHⅠ双酶切该β毒素基因，回收0.93kb的β毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含产气荚膜梭菌α毒素基因质粒pXETA1,与上述回收的β毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经NcoⅠ，NotⅠ酶切反应鉴定和苷酸序列分析证实，获得的重组质粒pXCPAB1含有α－β融合基因，重组菌株BL21（CD3）（pXCPAB1)表达产物经ELISA检测和SDS－PAGE分析，表明重组菌株可以表达α－β融合蛋白。     

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0的构建与免疫原性分析

利用SacⅠ、HindⅢ限制性内切酶分别对pMG36e与pMD19-T-E0进行双酶切,将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e,构建牛病毒性腹泻病毒E0基因重组表达质粒pMG36e-E0。提取重组质粒pMG36e-E0,进行双酶切鉴定及PCR鉴定。将阳性重组质粒pMG36e-E0转化到大肠杆菌DH5α中进行表达,对表达产物进行SDSPAGE和Western-blotting鉴定。用表达的E0蛋白二次免疫家兔,间接ELISA法检测其血清抗体水平。结果,重组质粒经双酶切得到大小分别约为3 600、691bp的2个片段,PCR扩增出691bp的片段,双酶切与PCR鉴定结果表明目的基因E0正确插入到载体pMG36e中。SDS-PAGE电泳结果表明E0基因在大肠杆菌获得了表达,表达产物相对分子质量大小约为27 000。Western-blotting分析结果证明表达产物能被BVDV阳性血清所识别。ELISA检测结果证明表达的E0融合蛋白能刺激动物产生抗体,具有天然蛋白的免疫原性。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)ZZ2004株核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

本研究旨在克隆并表达鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的核衣壳蛋白（N）。根据IBV ZZ2004株的N基因设计1对引物,提取IBV ZZ2004株的RNA,利用RT-PCR技术扩增大小约1.23 kb的片段,将其插入克隆载体pGEM-T构建pGEM-T-N。将pGEM-T-N用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切,将酶切后的N基因片段克隆到表达载体pGEX-6P-1,转入大肠杆菌BL21（DE3）菌中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳,结果显示外源基因获得了表达且为可溶性蛋白;Western blotting检测结果显示N蛋白可与相应的IBV ZZ2004阳性血清发生特异性反应,结果表明N蛋白有一定的生物活性。本研究为IBV诊断试剂盒及新型IBV重组亚单位疫苗研制奠定基础。     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

家蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因BmSPI3的克隆与表达特征分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)在机体的发育、免疫等生理过程中发挥重要的作用。从家蚕蛹cDNA文库中获得一条全长为728bp的基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现其蛋白具有保守的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(CⅠ-X3-CⅡ-X8-CⅢ-X14-CⅣ-X6-CⅤ-X13-CⅥ),且P1活性位点为赖氨酸(K),因此将该基因命名为BmSPI3(Gen-Bank登录号:DN237641)。通过PCR扩增BmSPI3基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-BmSPI3,并转化到E.coliBL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳检测在约36kD处有明显的蛋白表达条带。提取各发育时期蚕体和5龄幼虫各个组织的总RNA进行荧光定量PCR,检测结果表明:BmSPI3在5龄幼虫期表达量最高,卵期最低;在5龄幼虫表皮中的表达量最高,在马氏管的表达量最低。推测BmSPI3对胰蛋白酶和类胰蛋白酶具有抑制作用。     

鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及免疫原性分析

将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。     

羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增得到大小为1 188 bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21（DE3）中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。     

Cloning,Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of LpxB Gene of Brucella melitensis

The study was aimed to clone and express LpxB gene,and perform the bioinformatics analysis of protein.The genomic DNA of Brucella melitensis M5-90 was used as template.According to the genome sequence of M5-90 on GenBank,a pair of primers was designed.LpxB gene,which was 1 188 bp,was amplified by PCR,and was ligated into pMD20-T vector.The constructed recombinant plasmid pMD20-T-LpxB was transformed into E.coli DH5α.The recombinant plasmid was confirmed by endonuclease digestion and sequencing.The coding region of LpxB from pMD20-T was digested by BamHⅠ and XhoⅠ.Then,the fragment was inserted into prokaryotic expression vector pET-28a,and the positive plasmid was named pET-28a-LpxB.The pET-28a-LpxB was transformed into E.coli BL21 (DE3).The expressed protein was identified by SDS-PAGE and Western blotting.DNAMAN and BioEdit softwares were used to analyze the sequence of amino acids encoded LpxB gene.The results showed that the CDS of LpxB was successfully cloned and expressed.The secondary structure of LpxB protein consisted structure α -helix,extended strand,β-turn and random coil which accounted for 52.41％,14.94％,8.10％ and 24.55％,respectively.     

单增李斯特氏菌actA基因的克隆及原核表达

利用PCR技术从单增李斯特氏菌中扩增出actA基因,将PCR产物纯化后克隆到pMD 18Tsimple vector中,成功构建出克隆载体pMD-18T/actA。以BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pMD-18T/ActA和表达载体pGEX-3X,将纯化的actA基因亚克隆到表达载体pGEX-3X。构建的重组表达载体pGEX-3X/ActA转化到E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,可见约120 ku外源蛋白带,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应。该研究为ActA的生物学特性和功能的研究及诊断试剂的研制奠定了基础。     

猪生长分化因子11的原核表达及抗体制备

本研究旨在获得猪GDF-11的特异性抗体,以便于进一步研究猪GDF-11的功能.对猪GDF-11的编码区进行了克隆、表达载体的构建和转化、原核诱导表达和纯化以及将GDF-11注射到小鼠中并分离抗体.从猪胚肾中分离总RNA,经RT-PCR扩增得到猪GDF-11基因的编码区,插入pMD18-T载体中.再经限制性内切酶BarnH Ⅰ和EcoRⅠ双酶切,将回收的GDF-11酶切片段插入原核表达载体pGEX-4T-2中,获得重组原核表达质粒pGEX-4T-2-GDF-11.重组质粒经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导产生了65 ku的GST-GDF-11融合蛋白.融合蛋白经凝血酶酶切,分离纯化出42 ku左右的GDF-11蛋白;然后注射小鼠,制备了多克隆抗体,其滴度最高可达1:25 600,而且特异性好,表明得到了猪GDF-11的多克隆抗体.     

BALB/c小鼠Doppel蛋白的原核表达及其抗血清的制备

利用已克隆的BALB/c小鼠Doppel蛋白基因,将其成熟蛋白编码区亚克隆至表达载体pGEX-6P-1上,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-PRND。将重组蛋白表达载体转入E.coli BL21（DE3）中诱导表达,SDS-PAGE及Western blot分析结果表明,BALB/c小鼠Doppel蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。对表达的蛋白进行提取和纯化并免疫新西兰大白兔制备兔抗血清,初步建立了小鼠睾丸Doppel蛋白组织学分布的免疫组织化学方法。为进一步研究Doppel的结构、功能及其在TSEs发生发展中的作用提供基础材料和数据。