传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应，从１株传染性法氏囊病病毒性本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓｓＫ 粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。     

牛病毒性腹泻病毒P125基因重要区的比较与分析

根据牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）ＮＡＤＬ株的序列，以计算机辅助设计，化学合成１对引物（Ｗ１／Ｗ２）；应用ＲＴ－ＰＣＲ对国内不同地区分离的４株ＢＶＤＶ的Ｐ１２５基因外源序列插入区进行了扩增，并将扩增的片段进行克隆和序列测定，同时以ＤＮＡＳＩＳ和ＰＲＯＳＩＳ计算机软件将测定的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较分析。结果证实，国内分离的４株ＢＶＤＶ在这一区域中既没有外源序列的插入，也没有基因重组、基因重排或基因缺失，但存在某些核苷酸和氨基酸的替换，表明病毒的致细胞病变作用除与外源序列的插入、基因重组、基因重排或基因缺失有关外，可能还存在其他机制。核苷酸序列的同源性及系统树分析的结果表明，国内的ＢＶＤＶ毒株存在Ｉａ和Ｉｂ２个基因亚型，它们均属基因Ｉ型ＢＶＤＶ     

传染性腔上囊病病毒超强毒致弱株GZ20 VP2基因的克隆和序列分析

根据已发表的５２／７０株传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）基因组序列,设计并合成了一对物异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以超强毒ＩＢＤＶ（ｖｖＩＢＤＶ）致弱株ＧＺ２０基因组为模板利用技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ｐＵＣ１１９质粒上,得到重组ｐＵＣ１１９质粒。并对ＶＰ２基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株ＰＢＧ９８和弱毒株ＣＵ－１非常相似,而与经典强毒     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆和鉴定

以鸡胚成纤维细胞培养ＩＢＤＶ弱毒疫苗株Ｄ７８，经蔗糖密度梯度离心纯化，电镜下见典型ＩＢＤＶ粒子。用ＳＤＳ－蛋白酶Ｋ法提取病毒基因组，低熔点胶回收，琼脂糖凝胶电泳，可见ＩＢＤＶ典型双节段基因组。根据已发表的ＩＢＤＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＩＢＤＶＶＰ２基因的引物。以ＩＢＤＶ基因组为模板，利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物，将ＰＣＲ产物适当处理后与经ＳｍａⅠ酶切的ｐＵＣ１９质粒平端连接，转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含Ａｍｐ、Χ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ的琼脂平板上培养，产生大量白色菌落。挑取白色菌落，经质粒大小比较分析初步筛选到一重组质粒。以重组质粒ＤＮＡ为模板作ＰＣＲ检测和部分酶切分析证实，该质粒为含Ｄ７８ＩＢＤＶＶＰ２基因的重组ｐＵＣ１９     

超强传染性法氏囊病病毒株宿主保护抗原的分子特征

为了探索超强传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）株毒力增强的原因，采用反转录－聚合酶链反应技术，从中国广东、福建分离到的３株超强ＩＢＤＶ毒株中扩增到编码ＶＰ２蛋白的ｃＤＮＡ基因片段，并对ＶＰ２基因的高可变区进行了序列测定。序列分析和聚类分析表明，３株超强毒株与欧洲超强毒株非常相似，而与经典强毒株、弱毒株和变异株相差较大。将超强毒株ＶＰ２高可变区的氨基酸序列与其他血清Ⅰ型毒株进行比较，发现除了具有一般ＩＢＤＶ强毒株的分子特征之外，所有超强毒株在２２２、２５６、２９４和２９９位上的氨基酸均相同，分别为Ａ、Ⅰ、Ⅰ和Ｓ，与其他毒株均不相同。而２２２、２９４和２９９位上的特征性氨基酸使超强毒株ＶＰ２中诱导中和抗体的抗原决定簇的构象发生细微变化，从而导致毒力增强。     

鸡传染性支气管炎病毒沈阳分离株生物学特性及其免疫原S1基因的克隆与序列分析

本研究对分离自沈阳地区的一株传染性支气管炎病毒（ＳＹ毒株）进行了生物学特性的研究,同时成功地对其免疫原Ｓ１基因进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆与序列分析。 通过电镜观察、动物回归试验、血凝特性研究等试验验证分离自沈阳地区的ＳＹ毒株确实为一株传染性支气管炎病毒。气管环组织培养交叉中和试验结果表明,分离株ＳＹ株不同于参考毒株澳大利亚Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１,且不同于国内其它流行株ＨＤ、ＨＢ、ＸＢ、ＤＢ等,是一个新的变异株。 利用ＩＢＶ Ｓ１基因特异性寡聚核苷酸引物,经ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＳＹ毒株的Ｓ１基因,得到预期的约１．７Ｋｂ片段;并将扩增所得ｃＤＮＡ插入克隆质粒ｐＵＣ１９的ＥｃｏＲⅠ／ＢａｍＨⅠ位点,在大肠杆菌ＤＨ５ａ中实现目的基因的克隆。经限制性核酸内切酶分析及ＰＣＲ鉴定,证实为阳性重组质粒,利用末端双脱氧链终止法对其测序,得到Ｓ１基因全长１６４０ｂｐ,包括整个开放阅读框。通过序列分析软件ＤＮＡＳＩＳ、ＰＲＯＳＩＳ、ＭＥＧＡ等软件对Ｓ１基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明：分离株ＳＹ与７株参考株和国内流行株ＨＤ株相比,无论是核苷酸序列同源百分率还是氨基酸序列同源百分离都较低,均未达到８０％,这就提示我们ＳＹ毒     

传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区序列分析

根据传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）ＶＰ２基因ＣＤＮＡ序列,在ＶＰ２基因高变区设计一对引物,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＩＢＤＶ分离株ＪＳ３和ＪＳ４。将扩增片段克隆后以双脱氧链末端终止法测定核苷酸旬。ＪＳ３和ＪＳ４的同源性最高达９８％。与已发表的ｖｖＩＢＤＶ,ＩＢＤＶ变异要ＢＤＶ经典株为ＩＢＤＶ弱毒株核苷酸序列的同尖拨天９２￣９８％之间,根据ＩＢＤＶ的大ＯＲＦ推导出该片段蛋白的氨基酸序更,ＪＳ３和ＪＳ４的     

鸡新城疫病毒B95株融合蛋白基因的克隆与序列分析

以鸡新城疫病毒（ＮＤＶ）澳大利亚布里斯班分离株Ｒ９５的 ＲＮＡ为模板,运用的ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增其融合蛋白（Ｆ０）基因的ｃＤＮＡ。将扩增的Ｆ基因克隆到质粒ＰＵＣ１９中,转化入大肠杆菌ＪＭ１０９中,经ＡＩＸ平板筛选,ＰＣＲ等方法鉴定出Ｆ基因的阳性重组质粒,同时测定了Ｆ基因５’端７０９个核苷酸及３’端７６８个核苷酸的序列,对相应的氨基酸序列的研究表明,Ｂ９５株属弱毒株,含有Ｆ０中保守的疏水功能区和可糖基化位点,Ｂ９５与强毒株Ｆ４８Ｅ８株、Ｍｉｙａｄｅｒａ株和中等毒力的Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ Ｃ株的氨基酸序列的同源性在９０％左右。     

猪瘟病毒（HCV）石门株部分p23和p14基因的克隆,序列测定及与其…

应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株部分ｐ２３和ｐ１４基因，然后采用平端克隆法将扩增的ｃＤ－ＮＡ克隆到ｐＵＣ１９和ＳａｍⅠ位点，用双脱氧终止法牟重组质粒中的插入片段进行序列分析。将所测定的序列与其他１０株ＨＣＶ相同基因区域用ＤＮＡＳＩＳ计算机软件进行同源性比较和系统树分析。结果表明，大部分毒株为同一个型，该型共包括９个ＨＣＶ株，以Ｂｒｅｓｃｉａ株为代表，石门（Ｓｈｉｍｅｎ）株也属该型；而Ａ     

马传染性贫血病毒弱毒株LTR的克隆及序列分析

从马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）弱毒株感染的驴胎皮肤（ＦＤＤ）细胞中提取前病毒ＤＮＡ，以其为模板，通过ＰＣＲ扩增出ＥＩＡＶ弱毒株的ＬＴＲ，并将其克隆到载体质粒ｐＵＣ１９中。经酶切分析，ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选、鉴定，获得含有ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ片段的重组质粒ｐＬＴＲ。对该质粒的序列分析发现，在中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ的Ｕ３区含有４个与细胞转录因子结合的位点，其中有３个ＰＵ．１位点和１个ＡＰ－１位点，Ｕ３区还存在１个ＴＡＴＡＴＡＡ启动子序列；Ｒ区长为８１ｂｐ，含有１个帽位点ＧＧ和１个Ｐｏｌｙ（Ａ）信号序列ＡＡＴＡＡＡ；在帽位点下游是１个病毒Ｔａｔ蛋白结合位点，即ＴＡＲ位点；Ｕ５区长为３９ｂｐ。中国ＥＩＡＶ弱毒株ＬＴＲ序列与国外发表的其他毒株序列相比，在ＬＴＲ的一些调控部位有变异发生，中国ＥＩＡＶ弱毒株与美国ＥＩＡＶ原型株（Ｗｙｏｍｉｎｇ株）ＬＴＲ区核苷酸序列有１８．７２％的差异。     

传染性法氏囊病病毒VP2-4-3 cDNA的分子克隆和序列分析

从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。     

传染性法氏囊病病毒超强毒HZ株和XN株VP2基因的克隆和序列比较

根据已发表的５２／７０株ＩＢＤＶ基因组序列,设计并合成了一对特异扩增ＩＢＤＶ ＶＰ２基因的引物。以陕西地区分离的ＩＢＤＶ野毒ＸＮ株,ＨＺ株为材料,以其基因组为模板利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增出了１．５ｋｂ的ｃＤＮＡ产物,将ＶＰ２基因克隆于ＰＵＣ１１９质粒上,得到重组ＰＵＣ１１９质粒。     

IBDV地方变异株VP2基因的克隆与特性鉴定

应用 RT- PCR技术对 1株分离于地方免疫鸡群中暴发的传染性法氏囊病病例的传染性法氏囊病病毒 ( infec-tious bursal disease virus,IBDV) HN0 2 6株的 VP2基因进行了克隆与序列分析 ,并与相应毒株的 VP2高变区核苷酸及氨基酸序列进行了比较研究。结果表明 ,HN0 2 6株的核苷酸和氨基酸序列与变异株 Var- A的同源性最高 ,分别达97.3%和 97.6 % ;其次为超强毒株 UK6 6 1 ,分别为 95 .7%和 95 .2 % ;而和弱毒株 PBG98的同源率仅有 92 .8%和90 .3%。其中 ,在第一、二亲水区 ,HN0 2 6株均有 1个氨基酸发生了变化 ,即第 2 2 2位转变为 E、第 31 8位转变为 D。更重要的是 ,其 2 4 9位和 2 5 4位上的氨基酸分别为 K和 S,这些均为变异株的特性。另外 ,HN0 2 6株的七肽区保持SWSASGS不变 ,且第 2 79位和 2 84位氨基酸分别为 D和 A,又完全具备强毒株的特性。因此 ,初步确定所分离的HN0 2 6为有较强致病力的变异株 IBDV。     

Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Virus C4 Strain

This study was aimed to investigate the relationship between the virulence characteristics of infectious bursal disease virus(IBDV) C4 strain and its VP2 amino acid sequence. The RNA of IBDV C4 strain was extracted,and its VP2 gene was amplified by RT-PCR.VP2 nucleotide sequences and deduced amino acids of different virulent IBDV strains were compared. At the same time, prokaryotic expression vector pET-32a(+) was used to express the VP2 gene. The expression of recombinant VP2 protein was detected by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that the VP2 gene of IBDV C4 strain belonged to the very virulent infectious bursal disease virus (vvIBDV) in evolutionary relationship, the VP2 nucleotides homology between IBDV C4 strain and other vvIBDV strains were 98.1% to 98.7%, and there were no mutations in S-W-S-A-S-G-S (326-332 amino acids) and 222(A), 256(I), 294(I) and 299(S). The VP2 amino acid sequence of IBDV C4 strain was consistent with the characteristics of other vvIBDV strains. However, there were three differences amino acids sites at 201(D/G), 281(G/R) and 313(V/A) between the amino acids of the C4 strain and the very virulent strain UK661. And the change of 281(R) was in the small hydrophilic region of 279 to 290, which was related to the antigenicity of the virus; The recombinant VP2 protein molecular weight expressed in Escherichia coli BL21 was about 67 ku. This study provided a basis for further research on antigenic changes resulting from amino acid variation of 201(G), 281 (R) and 313(A). These results indicated that the VP2 gene of the IBDV C4 strain was consistent with the major characteristics of the vvIBDV strain VP2 gene. The difference of three amino acid sites in the vvIBDV strain C4 might be related to the evolution of virulence of IBDV strain in China.     

传染性法氏囊病病毒C4毒株VP2基因的原核表达及生物信息学分析

试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。     

Sequence analysis of both genome segments of three Croatian infectious bursal disease field viruses

In order to determine the mutations responsible for virulence, three Croatian field infectious bursal disease viruses (IBDV), designated Cro-Ig/02, Cro-Po/00, and Cro-Pa/98 were characterized. Coding regions of both genomic segments were sequenced, and the nucleotide and deduced amino acid sequences were compared with previously reported full-length sequenced IBDV strains. Phylogenetic analysis, based on the nucleotide and deduced amino acid sequences of polyprotein and VP1, was performed. Eight characteristic amino acid residues, that were common to very virulent (vv) IBDV, were detected on polyprotein: 222A, 256I, 294I, 451L, 685N, 715S, 751D, and 1005A. All eight were found in Cro-Ig/02 and Cro-Po/00. C-Pa/98 had all the characteristics of an attenuated strain, except for glutamine on residue 253, which is common for vv, classical virulent, and variant strains. Between less virulent and vvIBDV, three substitutions were found on VP5: 49 G --> R, 79 --> F, and 137 R --> W. In VP1, there were nine characteristic amino acid residues common to vvwIBDV: 146D, 147N, 242E, 390M, 393D, 511S, 562P, 687P, and 695R. All nine residues were found in A-Ig/02, and eight were found in B-Po/00, which had isoleucine on residue 390. Based on our analyses, isolates Cro-Ig/02 and Cro-Po/00 were classified with vv IBDV strains. C-Pa/98 shared all characteristic amino acid residues with attenuated and classical virulence strains, so it was classified with those.