表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

H9N2 AIV灭活疫苗免疫SPF鸡攻毒后肺组织免疫相关基因表达变化研究

[目的]本试验旨在探究H9N2亚型禽流感病毒攻击对H9灭活疫苗免疫SPF鸡呼吸系统的影响。[方法]选用36只3周龄SPF鸡,随机分为对照组(Con)、攻毒组(Flu)、免疫后攻毒组(Vac+Flu)。以每只0.4 mL剂量免疫接种H9灭活疫苗,3周后以10⁶ EID₅₀的病毒量进行攻毒,采集拭子、血清、气管、肺组织等样品,通过血凝抑制(HI)试验、RT-PCR、荧光定量PCR(qPCR)等方法检测血清中HI抗体滴度、肺脏流感病毒M基因拷贝数以及免疫相关基因CD4、CD8、GATA3、T-bet、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ、Perforin、Granzyme、FasL、Fas等的表达量;并利用HE染色、免疫组织化学的方法观察气管、肺脏的病理变化及病毒特异性抗原NP蛋白的分布特征。[结果]HI试验结果显示,SPF鸡疫苗免疫后可产生较高的H9N2 AIV抗体效价。免疫保护试验和RT-PCR结果显示,SPF鸡疫苗免疫后攻毒仍能检测到机体排毒和流感病毒M基因在肺脏组织中的表达。HE染色和免疫组化结果显示,接种H9N2 AIV灭活疫苗后...     

悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养

【目的】为评估细胞源重组禽流感病毒H5亚型灭活疫苗的有效性提供数据支持。【方法】选取一株来源清楚的贴壁MDCK细胞,通过逐步降低培养基中血清含量及不断调整无血清培养基配方,将其驯化为悬浮MDCK细胞,并以此为基质增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株和H5N1 Re-8株;比较不同毒株在贴壁和悬浮MDCK细胞中增殖的差异。分别将经悬浮MDCK细胞增殖的病毒与经SPF鸡胚增殖的病毒制备成重组禽流感病毒(H5亚型)三价灭活疫苗,免疫商品蛋鸡和商品鸭,通过血清学方法比较细胞源与鸡胚源禽流感灭活疫苗的免疫效果。海兰褐商品蛋鸡:6 050只,分为3组,2组为免疫组,每组3 000只,28日龄免疫0.5 mL/只,80日龄免疫0.5 mL/只;不免疫对照组1组,50只,同等条件下隔离饲养。分别于蛋鸡日龄49、110、210 d(即首免后21 d、82 d、6个月)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。长白飞鸭:220只,分为3组,2组为免疫组,每组100只,10日龄免疫0.5 mL/只,24日龄免疫1.0 mL/只,不免疫对照组20只,同等条件下隔离饲养。分别于鸭日龄24、38、52 d(即首免后14、28、42 d)时采血分离血清,测定禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株的HI抗体效价,监测抗体消长。【结果】获得一株可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞,摇瓶、5L生物反应器中的培养数据及细胞状态显示,该细胞株适合放大生产。此悬浮MDCK细胞培养48 h细胞密度可由1.5×10~6 cells/mL左右增殖到1.0×10~7 cells/mL左右,状态良好、活率高、单个悬浮于培养基中。以此悬浮MDCK细胞为基质增殖重组禽流感病毒,H5N1 Re-6株的HA效价达1﹕512,TCID_(50) 10~(7.67)/mL,EID_(50) 10~(7.83)/0.1 mL;H5N1 Re-7株的HA效价达1﹕256,TCID_(50)达10~(7.33)/mL,EID_(50)10~(7.17)/0.1 mL;H5N1 Re-8株的HA效价达1﹕1024,TCID_(50) 10~(8.5)/mL,EID_(50) 10~(8.38)/0.1 mL,与经贴壁MDCK细胞增殖的病毒毒价相当。细胞源三价灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡,首免后21 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕446、1﹕111、1﹕416,二免后30 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕588、1﹕362、1﹕776,6个月时分别为1﹕239、1﹕128、1﹕223,维持了较高的抗体水平;免疫长白飞鸭,首免后14 d时,禽流感H5亚型Re-6株、Re-7株、Re-8株HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕30、1﹕17、1﹕64,28 d时三者HI抗体效价几何平均值(GMT)分别为1﹕194、1﹕91、1﹕137,42 d时分别为1﹕416、1﹕128、1﹕239;以上两组的试验结果与鸡胚源重组禽流感灭活疫苗免疫后诱导产生的HI抗体效价相当。【结论】经驯化获得的可在无血清培养基中悬浮生长的MDCK细胞株,其增殖重组禽流感病毒H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、H5N1 Re-8株能力强,且病毒被制备成灭活疫苗免疫海兰褐商品蛋鸡和长白飞鸭可产生较高水平的抗体。为大规模工业化生产禽流感疫苗提供技术支持。     

H_3N_2亚型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的制备与活性分析

[目的]为减少鼠源单克隆抗体的异源性在犬临床治疗中引起的宿主免疫排斥反应,针对H_3N_2亚型犬流感病毒(CIV),制备具有犬源抗体恒定区基因(Fc)的鼠/犬嵌合抗体。[方法]从产生具有良好中和活性CIV单抗的鼠源杂交瘤细胞株中扩增抗体重链和轻链可变区基因,通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得单链抗体基因(scFv)片段,同时从犬外周血单核细胞中扩增得到犬源抗体Fc片段;分别构建单链抗体与嵌合抗体表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化后调整蛋白浓度为1 mg·mL~(-1),检测单链抗体与嵌合抗体的ELISA和血凝抑制(HI)效价,并分析其对病毒感染细胞的中和活性。[结果]获得的H_3N_2亚型CIV鼠源scFv的相对分子质量为45×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶640(1.56μg·mL~(-1))和1∶160(6.25μg·mL~(-1)),中和效价为1∶160(6.25μg·mL~(-1));鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的相对分子质量为80×10~3,ELISA及HI效价分别为1∶2 560(0.39μg·mL~(-1))和1∶640(1.56μg·mL~(-1)),中和效价为1∶40(25μg·mL~(-1))。[结论]成功制备了H_3N_2亚型CIV鼠/犬嵌合抗体,为犬流感的临床治疗提供了物质基础。     

蛋鸡H5灭活疫苗抗体消长规律的试验

为了在临床上制定合理的禽流感疫苗免疫程序,用重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-5株+Re-4株)分别在14日龄、49日龄、105日龄免疫蛋鸡,免疫剂量分别为0.3ml/只、0.5ml/只、0.5ml/只。分别在第1、6、10、14、20、28、35、42、49、56、63、70、77、86、94、105、120、150、180日龄采血测定HI抗体效价。结果表明首免后HI抗体上升较慢较低,只有第二次免疫后,抗体才迅速升高。在70日龄(二免后3周)时H5N1,Re-4HI抗体达到9.601og2,H5N1,Re-5HI抗体达7.861og2。在120日龄(三免后2周)时H5N1,Re-4HI抗体达到9.301og2,H5N1,Re-5HI抗体达到9.251og2。     

中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型蛋鸡禽流感抗体效价的影响

【目的】研究肌注中药复方多糖对不同MHC B-LβⅡ基因型蛋鸡血清中禽流感抗体效价的影响。【方法】试验采用PCR-SSCP方法将500羽京红1号蛋鸡按不同基因型分组,再将各基因型组分成高、中、低剂量中药复方多糖组和空白对照组。各组试验鸡分别于8日龄肌注50、25和12.5 mg/mL中药复方多糖和生理盐水,0.2 mL/只,连续7 d,于27、35、42、49日龄从各组随机抽取5只试验鸡,翅下静脉采血并分离血清,用微量血凝抑制试验(HI)检测血清中H5与H9亚型禽流感抗体效价。【结果】免疫前,各剂量中药复方多糖组H5N1 Re-6和H9N2母源抗体平均效价高于对照组,且高剂量AA和BC基因型鸡血清中H5N1母源抗体效价显著高于对照组(P0.05);免疫后7 d,AA基因型鸡高、中、低剂量组的H5亚型禽流感抗体效价均显著高于对照组(P0.05),BC基因型鸡高剂量组H5亚型禽流感抗体效价显著高于对照组(P0.05),BC基因型鸡高、中、低剂量组H9亚型禽流感抗体效价显著高于对照组(P0.05);免疫后14 d,AA基因型鸡高、中剂量组H5亚型禽流感抗体效价显著高于对照组(P0.05),BB基因型鸡中剂量组显著高于对照组(P0.05),BC基因型鸡中剂量组H9亚型禽流感显著高于对照组(P0.05);免疫后21 d,BC基因型鸡高、中剂量组H5亚型禽流感显著高于对照组(P0.05),BC基因型鸡高剂量组显著高于对照组(P0.05)。【结论】不同剂量中药复方多糖均能不同程度的提高各基因型蛋鸡血清中H5和H9亚型禽流感抗体效价,且以中剂量和高剂量效果好。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

欧亚类禽型H1N1猪流感病毒HA蛋白的表达及免疫原性评估

【目的】 表达欧亚类禽型（eurasian avian-like,EA）H1N1猪流感病毒（SIV）的血凝素（HA）蛋白,并对其免疫原性进行测定。【方法】 利用RT-PCR技术扩增病毒A/swine/Zhejiang/245/2013（H1N1）(ZJ245)的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS中,获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),将其转染293T细胞,采用间接免疫荧光（IFA）检测和Western blot检测HA蛋白在体外的表达;将重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)经肌肉注射途径、以100 μg/只剂量免疫16只6周龄BALB/c小鼠（I组和II组）,间隔3周后进行加强免疫（二免）;同等数量的小鼠以相同方式注射100 μL无菌PBS作为非免疫对照组（III组和IV组）。首免和二免每周采血,分别采用血凝抑制（HI）试验和病毒中和（VN）试验两种方法测定不同类型的血清抗体效价;二免2周后,其中两组小鼠（I组和III组）用50 μL（10 ^6.0EID₅₀）的ZJ245病毒经滴鼻感染途径进行攻毒,另外两组（II组和IV组）用A/swine/Heilongjiang/44/2009（H1N1）（HLJ44）病毒进行攻毒。攻毒后14 d内每天观察小鼠的临床症状、统计发病与死亡情况,且每天称量小鼠体重,在体重下降比率超过25%时判定为小鼠死亡。攻毒后第3 天,每组随机剖杀3只小鼠,分别采集脑、鼻甲、肺、脾和肾等脏器,匀浆处理后通过接种10日龄的非免疫鸡胚测定脏器的病毒含量。通过小鼠体重变化以及脏器滴定的病毒含量评估重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫保护效果。 【结果】 经酶切鉴定和测序验证表明ZJ245的HA基因的已正确克隆至真核表达质粒pCAGGS中获得重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245),经体外转染293T细胞后,IFA和Western blot证实了病毒的HA蛋白能够正确表达,并具有良好的生物学活性;小鼠的免疫与攻毒试验结果表明,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)首免后一周可检测到针对同源病毒ZJ245的低水平HI和VN抗体,加强免疫后抗体水平明显升高,HI抗体达到76.88、VN抗体达到152.5;同时针对异源病毒HLJ44也产生了较低水平的HI和VN抗体。10 ^6.0EID₅₀的同源病毒ZJ245攻毒时,与非免疫组小鼠相对比,重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)的免疫完全阻止了因病毒攻击而导致的小鼠体重下降以及肺脏和鼻甲内病毒的复制;10 ^6.0EID₅₀的异源病毒HLJ44攻毒时,相比非免疫组小鼠,质粒免疫组小鼠体重的下降比率、以及肺脏和鼻甲内的病毒滴度均显著降低（P<0.0001、P <0.001、P <0.05）。 【结论】 重组质粒pCAGGS-HA(ZJ245)能够有效表达病毒HA蛋白,免疫后可使小鼠获得完全抵抗ZJ245感染及部分抵御HLJ44感染的免疫保护力,表明重组质粒 pCAGGS-HA(ZJ245)具有良好的免疫原性。     

不同种植密度对花生主要性状及产量的影响

【目的】研究不同密度处理下对花生农艺性状及产量的影响,分析密度与产量的最佳配置。【方法】选取3种花育系列花生品种(花育25号、花育33号和花育36号),设置4个种植密度水平(1.2×10⁵、1.5×10⁵、1.8×10⁵和2.1×10⁵穴/hm²)处理进行列区设计试验,测定不同种植密度下各花生品种的主茎高、侧枝长等主要农艺性状以及产量,筛选最佳种植密度。【结果】密度为1.2×10⁵~1.5×10⁵穴/hm²主茎高要显著大于密度为1.8×10⁵~2.1×10⁵穴/hm²;密度处理为1.5×10⁵穴/hm²的侧枝长比其他处理显著高出1~6.8 cm;单株果数和饱果数均在低密度下最大,随密度的增大而减小;种植密度对总分枝和结果枝影响差异不显著;花育33号在种植密度为1.5×10⁵穴/hm²时产量为最大,为4 555.58 kg/hm²,其次是花育36号、密度为1.8×10⁵穴/hm²处理,第三是花育25号、密度为1.5×10⁵穴/hm²处理。【结论】花育系列花生品种种植密度为1.5×10⁵~1.8×10⁵穴/hm²。     

感染H3N2亚型SwIV荣昌仔猪组织脏器的损伤及其载毒分析

【目的】明确H3N2型SwIV对仔猪组织脏器引起的损伤变化及其在组织中的载毒情况。【方法】试验采用H3N2型SwIV接种鸡胚扩增病毒,Reed-Muench法检测病毒EID_(50),滴鼻感染H1N1和H3N2抗体为阴性的仔猪,5 d后剖解观察仔猪临床病理变化,RT-PCR检测病毒在主要组织脏器中的载毒情况。【结果】感染H3N2型SwIV仔猪在5 d内未出现典型的临床症状,但是其肺脏组织有明显淤血和损伤坏死,肺泡壁增厚,肺泡内有纤维性渗出物和炎症细胞的聚集。组织中载毒检测结果显示主要载毒于肺脏组织中。【结论】感染H3N2型SwIV仔猪不一定出现典型临床症状,但其组织受到严重损伤,且主要载毒于肺脏组织。     

种植密度对菊芋块茎产量、植株光能截获及养分转运特性的影响

【目的】探究种植密度对菊芋块茎产量、植株光能截获及养分吸收转运特性的影响，确定适宜种植密度，为菊芋优化栽培种植及高产稳产提供理论依据。【方法】2019—2020年分别于河南省新乡市和南阳市布置菊芋密度效应田间试验。以“南芋1号”为供试材料，设置5个种植密度，分别为：D1(1.80×10⁴株·hm^-2)、D2(2.25×10⁴株·hm^-2)、D3(2.70×10⁴株·hm^-2)、D4(3.15×10⁴株·hm^-2)和D5(3.60×10⁴株·hm^-2)。于菊芋成熟期(mature period, MP)测试块茎产量，并分别于营养生长中期(medium the vegetative period, MVP)、营养生长末期(late the vegetative period, LVP)和开花期(flowering period, FP)测试地上部植株生物量和氮磷钾养分含量，...     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。     

一例比格犬肺炎克雷伯氏菌病的诊断及防控

为了诊断青岛博隆实验动物养殖基地比格犬病死原因并制定有效防控措施,试验通过临床观察和病理解剖对病犬进行初步诊断;无菌采集病死幼犬肺组织,采用特异性聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)诊断三种常见犬呼吸道病毒,通过细菌形态学观察、生化试验、基因测序鉴定分离病原菌,并通过小鼠致病性试验和药敏试验分析其致病性和优化用药方案。结果表明：犬发病时主要表现为咳嗽、流鼻涕、食欲不振和轻度腹泻等症状。剖检可见胸腔积液,肺叶淤血和坏死。PCR鉴定犬腺病毒2型(canineadenovirus type 2, CAV 2)、H3N2亚型犬流感病毒(H3N2 subtype canine influenza virus, CIV)和犬副流感病毒(canine parainfluenza virus, CPIV)均为阴性。细菌分离培养显示为该菌革兰氏阴性的粗短杆菌;生化试验和16S rDNA测序鉴定该菌为肺炎克雷伯菌。回归试验结果表明该菌可引起小鼠肺炎症状,具有较强致病力。药敏试验结果显示分离菌株对阿奇霉素、环丙沙星、恩诺沙星敏感,对氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、头孢...     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗免疫SPF鸭免疫持续期试验

试验对重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗免疫SPF鸭后的免疫持续期进行了研究。选用14日龄SPF鸭20只,其中10只鸭的腿部肌肉接种免疫灭活疫苗,剂量为0.5 m L·只-1,另10只不接种的鸭作为对照组。结果表明,免疫后14 d可以产生较高的免疫力,H5N1 Re-8株的抗体效价平均增值为5.6 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均增值为6.6 log2。到35 d产生的HI抗体效价平均值达到高峰,H5N1 Re-8株的抗体效价平均增值为8.6 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均增值为9.5 log2。第120天H5N1 Re-8株抗体效价平均值为4 log2,H7N9 H7-Re-1株的抗体效价平均值均为5 log2,为抗体的保护临界值。根据此数据分析,一次免疫的免疫保护期约为120 d。     

高温养殖条件下饲用凝结芽孢杆菌对肉鸡肠道健康的影响

【目的】研究饲用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)对高温养殖肉鸡生长性能及肠道健康的影响。【方法】将320只28日龄AA肉公鸡分为阳性对照组[即常温组，normal temperature,NT,(22±1)℃]、阴性对照组[即高温组，high temperature,HT,(34±1)℃]和3个试验组。NT和HT组饲喂基础日粮；3个试验组在HT组基础日粮中分别添加0.2×10⁷、1.0×10⁷和5.0×10⁷ CFU/g凝结芽孢杆菌，分别记为HT-BC_0.2、HTBC_1.0和HT-BC_5.0组。【结果】与NT组肉鸡相比，HT组肉鸡的平均日增质量、平均日采食量、空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度、空肠食糜乳酸杆菌数和乳酸杆菌数/大肠杆菌数均显著降低(P<0.05)，料重比和空肠食糜大肠杆菌数显著增加(P<0.05)。与HT组肉鸡相比，HT-BC_1.0和HT-BC_5.0组肉鸡的平均日增质...     

氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立

【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病,不合理使用导致在动物性食品中残留,严重危害消费者健康,其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs单克隆抗体（mAbs）,建立间接竞争ELISA（icELISA）检测方法,为动物性食品中FQs多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A）,质谱鉴定;分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA）,紫外和红外光谱鉴定是否偶联成功;CPFX-A-BSA 免疫Balb/c小鼠,间接ELISA和icELISA方法测定多抗血清效价和敏感性,选取抗血清效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合;NS0细胞和脾细胞按1﹕5比例在PEG-1500作用下融合,筛选抗FQs杂交瘤细胞株,并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定;体内诱生腹水法制备mAb,液体石蜡作为诱导剂,每只鼠注射10⁸个杂交瘤细胞;选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb,建立icELISA标准曲线,对icELISA检测方法优化,在鸡肉中添加10种FQs进行测定,将测定结果与HPLC法比较,用SPSS 17.0软件进行显著差异性分析。【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功;3只鼠血清效价均达到1﹕1.28×10⁴以上,2号鼠血清效价最高（1﹕2.56×10⁴）,且IC₅₀值最低（12.92 ng·mL^-1）,选择2号鼠作为细胞融合用鼠;4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏感广谱特异的杂交瘤细胞,分别命名为2H5、3D11、4F4,细胞上清效价分别为1﹕1 600、1﹕1 600和1﹕800,腹水效价分别为1﹕1.6×10⁶、1﹕8.2×10⁵和1﹕8.2×10⁵;icELISA方法的包被原浓度为1 μg·mL^-1,5%猪阴性血清4℃包被过夜,单抗1﹕40 000稀释,山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP） 1﹕8 000稀释;反应温度均为37℃,标准品与单抗同时加入反应15 min,洗板后加二抗反应25 min;显色10 min,2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异性最好,2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219,R²=0.9 782,对10种FQs的IC₅₀值分别为环丙沙星（CPFX）1.67 ng·mL^-1、诺氟沙星（NOR）1.82 ng·mL^-1、培氟沙星（PEF）1.97 ng·mL^-1、恩诺沙星（ENR）1.54 ng·mL^-1、单诺沙星（DAN）2.79 ng·mL^-1、洛美沙星（LOM）3.38 ng·mL^-1、氧氟沙星（OFL）5.50 ng·mL^-1、麻保沙星（MAR）4.40 ng·mL^-1、沙拉沙星（SAR）11.76 ng·mL^-1、二氟沙星（DIF）13.60 ng·mL^-1,与10种FQs的交叉反应率为12.3%-108.4%,与非FQs交叉反应率均低于0.01%,对10种FQs的检测限（LODs）为0.09 ng·mL^-1-0.64 ng·mL^-1。icELISA法鸡肉中10种FQs的回收率为80.5%-91.8%,HPLC法的回收率为85.1%-95.7%,二者变异系数均低于10.0%;两种检测方法差异不显著（P＞0.05）。【结论】该试验获得了高效价、敏感、广谱特异性的mAbs,建立的icELISA方法可用于同时检测鸡肉中10种FQs。     

云南省畜禽粪肥养分资源供给定量估算及其替代化肥潜力分析

【目的】基于云南省种养业发展现状，综合考虑农作物种植面积、种植结构以及畜禽粪便处理技术等因素，估算畜禽粪肥养分资源现状及其替代化肥的潜力。【方法】基于文献资料和统计学方法进行数据处理，估算云南省农业种植养分需求量和畜禽粪肥养分资源供给量，采用情景分析评估畜禽粪肥资源利用模式，评价其替代化肥潜力。【结果】(1)云南省农作物氮、磷、钾养分需求量分别为70.27×10⁴、18.22×10⁴和65.89×10⁴ t，畜禽养殖粪便氮、磷、钾养分供应量分别为47.30×10⁴、8.82×10⁴和45.98×10⁴ t。(2)固体粪便堆肥加工为有机肥、液体粪便进行沼液发酵为最佳处理模式，可提供的氮、磷、钾养分量分别为36.83×10⁴、7.90×10⁴和41.59×10⁴ t，分别占作物需求量的52.41%、43.36%和63.12%。(3)在秸秆还田的前提下，云南省氮肥替代幅度为52.41%～72.05...     

山东省作物秸秆和畜禽粪尿有机肥资源现状及替代化肥潜力分析

【目的】计算作物秸秆、畜禽粪尿资源数量及养分总量,分析其替代化肥潜力,为统筹与合理利用全省有机肥资源提供数据支撑。【方法】对不同作物(小麦、玉米、水稻/稻谷、大豆、马铃薯、花生和棉花)和畜禽(牛、猪、羊、家禽和兔),利用草谷比和排泄系数法,估算山东省2016—2020年作物秸秆和畜禽粪尿资源总量及养分总量,分析变化趋势,计算不同区域和种类有机肥替代化肥潜力。【结果】(1)2020年全省作物秸秆资源总量为7 616.8×10⁴ t,养分总量为163.2×10⁴ t,N、P₂O₅、K₂O养分量分别为63.6×10⁴、9.2×10⁴和90.5×10⁴ t。秸秆养分资源理论替代化肥潜力为42.9%,实际替代化肥潜力为20.9%;秸秆中N、P₂O₅、K₂O资源理论替代化肥潜力分别为35.3%、9.0%和92.2%,实际替代化肥潜力分别为12.5%、4.2%和...     

3株广西麻雀源H9N2亚型禽流感病毒对SPF鸡的致病性

【目的】明确麻雀源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)对鸡群的致病性,既有利于了解麻雀在H9N2亚型AIV传播生态链中的作用,对科学防控H9N2亚型AIV的暴发流行也具有重要意义。【方法】选取3株HA基因处于不同进化分支的广西麻雀源H9N2亚型AIV进行SPF鸡致病性试验,将84羽4周龄SPF鸡随机均分为4组(空白对照组和3个感染组)。感染组每组以100μL稀释至106EID₅₀/100μL的病毒液经鼻腔感染16羽SPF鸡,于病毒感染24 h后分别在各感染组放入剩余的5羽SPF鸡作为空白接触组,感染后观察鸡群的临床症状及剖检病理变化,在不同时间点采集器官组织制作病理切片并检测不同器官中的病毒滴度及分布情况。【结果】3株麻雀源H9N2亚型AIV在HA蛋白裂解位点处不存在多个碱性氨基酸插入现象,表现为RSSR↓GLF,符合低致病性AIV(LPAIV)的典型分子特征;对鸡胚的半数感染量(EID₅₀)在10-6.0/0.2 mL~10-6.8/0.2 mL,半数致死量(ELD₅₀)在10-6.8/0.2 mL~10-7.2/0.2 mL。3株H9N2亚型AIV均可直接感染SPF鸡,且病毒在不同器官中的滴度及分布存在一定差异;感染SPF鸡后均未表现出明显的临床症状和死亡现象,但在上呼吸道的气管及肺脏出现一定程度的充血和出血、气管纤毛脱落及炎性淋巴细胞浸润等病变。3株麻雀源H9N2亚型AIV感染SPF鸡后的排毒期主要介于第1~7 d,且能不经体内适应而直接感染鸡群并排毒;3株麻雀源H9N2亚型AIV在SPF鸡各器官中的复制能力存在一定差异,可在气管和肺脏中进行有效复制,而在肝脏、脑、胰腺、胸腺、心脏、盲肠扁桃体及法氏囊中均未检测到对应的病毒。【结论】麻雀源H9N2亚型AIV可直接感染鸡群且具有在鸡群间水平传播的潜在风险,提示在家禽饲养、运输及销售等环节要做好相关的防护措施,切断AIV在野鸟与家禽间的传播途径,减少禽流感暴发造成的经济损失。     

杂交棉LAI动态特征的密度效应

【目的】研究棉花不同密度群体叶面积系数(LAI)特征参数的密度效应,应用作物高产群体相对LAI动态普适模型方程y=(a+bx)/(1+cx+dx²)模拟分析不同密度对LAI动态特征参数的影响。【方法】选用不同基因型杂交棉品种兆丰1号(陆陆杂交F₁代)和新陆中31号(海陆杂交F₁代)为供试品种,2016年4月22日播种。膜下滴灌栽植配置(10+66+10+66+10+66)cm,1管3行模式。设置8个种植密度处理(按收获株数),分别是7.20×10⁴、10.24×10⁴、13.14×10⁴、16.58×10⁴、19.62 ×10⁴、22.26×10⁴、24.70×10⁴和28.80×10⁴株/hm²(分别记为T1、T2、T 3、T 4、T 5、T 6、T 7、T 8),随机区组排列,重复3次,每区种植3膜18行,面积74.8 m²。【结果】棉花群体最大LAI在7.2×10⁴~28.8×10⁴株/hm²范围内随密度增加呈近似直线增大趋势,而最大LAI出现的时间随密度增加而提早;将LAI数据相对化处理后,不同密度群体的LAI差异在最大LAI之后较之前表现明显,高密度群体较低密群体LAI衰减迅速。全生育期平均LAI随密度增加呈显著线性增大趋势。密度对模拟方程各参数均有不同程度的影响。全生育期群体LAI变化速率呈“N”形变化趋势,且与群体LAI变化及生育期对应,高密度群体LAI增加及衰减的速率均大于低密度群体。【结论】密度对棉花全生育群体LAI动态具有显著的调节作用,尤其群体LAI变化速率、最大LAI及其到达的时间、平均LAI等重要特征参数对密度响应较为敏感,可作为对棉花群体密度调控的参考指标。