牛-干扰素在昆虫细胞中的高效表达

应用RT-PCR技术从经植物血凝素(PHA)刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛-γ干扰素基因(bovine interferon-γ,BovIFN-γ)cDNA,并克隆到pGEM-T easy载体中,经过限制性酶切分析和测序证实,所克隆到的基因编码区序列与已报道的序列完全一致。将含信号肽的BoIFN-γ基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒转座载体pFastBac中,构建了转移载体pFastBac-BoIFN-γ,转座到宿主菌DH10Bac中,在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的KGTIX LB平板上筛选白色菌落,提取DNA获得重组穿梭载体Bacmid-BoIFN-γ质粒,与脂质体共转染Sf9细胞,产生有感染力的重组杆状病毒reBac-BoIFN-γ。重组病毒经过传代扩增感染Sf9细胞,通过IFA试验、Western-blot和抗病毒活性测定证实,BoIFN-γ基因在感染的昆虫细胞和上清中得到了表达,上清中活性可达2.651×105U/mL。表达条件优化结果表明,不同MOI对rBoIFN-γ的表达产量影响不大,上清中干扰素活性在感染后5d达到高峰。     

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素和λ1干扰素

牛干扰素可用于对各种类型牛传染性疾病的预防和治疗。利用家蚕杆状病毒表达系统表达牛α干扰素(BoIFN-α)及牛λ1干扰素(BoIFN-λ1)。首先对BoIFN-α和BoIFN-λ1的编码基因序列进行优化合成,优化合成的BoIFN-α和BoIFN-λ1基因的密码子适应指数(CAI)值提高,更适合在家蚕中表达,且翻译后的氨基酸序列与原始氨基酸序列完全一致。将优化合成的2个基因序列分别克隆至杆状病毒转移载体pVL1393,与缺失了orf1629的亲本杆状病毒BmBacmid共转染Bm N细胞,通过同源重组将BoIFN-α和BoIFN-λ1基因插入到杆状病毒多角体蛋白基因启动子下游,获得重组病毒rBmBac-BoIFN-α和rBmBac-BoIFN-λ1。用纯化的重组病毒感染家蚕5龄幼虫融合表达BoIFN-α和BoIFN-λ1干扰素,并通过PCR鉴定了2个目标蛋白基因在蚕体内的复制。采用微量细胞病变抑制法在Vero/VSV*GFP表达系统检测蚕体中表达重组BoIFN-α的效价可达1.0×10~6U/mL左右,重组BoIFN-λ1的效价可达5.01×10~4U/m L左右。试验结果提示,利用家蚕杆状病毒表达系统在蚕体内表达牛α干扰素及牛λ1干扰素是生产牛干扰素制剂更加廉价而高效的途径。     

密码子优化的鸡白细胞介素-17在昆虫细胞中的表达研究

为了获得具有良好生物学活性且具有较高表达量的鸡白细胞介素-17(ChIL-17),本研究在前期研究工作基础上,将ChIL-17的编码基因按照真核细胞(昆虫细胞)偏爱的密码子进行优化改造,经全基因合成后插入到转座载体pFastBacTM Ⅰ中,构建重组转移质粒pfast-mod.ChIL-17并转化DH10Bac感受态细胞.通过位点特异性转座将mod.ChIL-17基因整合到穿梭质粒Bacmid中,获得重组穿梭质粒Bacmid-mod.ChIL-17.应用脂质体将重组穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-mod.ChIL-17.重组病毒传代扩增感染Sf9细胞,通过间接免疫荧光检测目的蛋白的表达.结果表明,经过优化的ChIL-17在杆状病毒系统中获得表达.     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因在杆状病毒表达系统中的表达

将鸡传染性贫血病毒M9905株VP1、VP2基因分别或同时克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDUAL中，然后转化到DHIOBAC感受态细胞中与Bacmid杆状病毒穿梭载体进行转座重组，最后将重组子转染Sf9昆虫细胞，得到分别或同时含VP1、VP2基因的重组杆状病毒rBacVP1、rBacVP2及rBacVP1—2。PCR扩增结果证实VP1、VP2基因重组到杆状病毒基因组中；SDS-PAGE电泳分析和间接免疫荧光试验结果表明VP1、VP2基因在重组病毒中得到了表达。     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

鸭源新城疫病毒F基因在昆虫细胞中的表达和鉴定

为在昆虫细胞中表达鸭源新城疫病毒(NDV) F蛋白,本试验首先根据鸭源NDV F基因序列设计引物,PCR扩增出F基因,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1,获得重组转座载体pFastBac-F,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-F。Western blotting、间接免疫荧光试验结果均显示表达的重组蛋白能与鸭抗NDV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。结果表明鸭源NDV F蛋白在昆虫细胞中获得了成功表达,为鸭新城疫的预防控制奠定了基础。     

犬干扰素α2与犬白蛋白融合基因在昆虫细胞中的表达与活性分析

本研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物活性的犬白蛋白-犬干扰素α2(albumin-CaIFN-α2)。将蜂素信号肽(HBM)、犬血清白蛋白(Alb)与犬干扰素α2的融合基因经密码子优化后,连接至转移载体pFastBac1中,获得了重组pFastBac1-HBM-Alb-CaIFN-α2,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过三次蓝白斑筛选纯化,得到的重组穿梭质粒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2转染Sf9细胞,72 h后可观察到明显的细胞病变。用第三代重组杆状病毒rBac-HBM-Alb-CaIFN-α2感染Sf9昆虫细胞,感染3 d后,收获昆虫细胞和细胞培养物,间接免疫荧光(IFA)结果显示,重组杆状病毒感染的细胞呈现绿色荧光;Western blot检测结果显示,在约90 ku左右可观察到特异性条带,证实重组Alb-CaIFN-α2能够在昆虫细胞中表达。利用MDCK/VSV微量细胞病变抑制法检测重组Alb-CaIFN-α2的抗病毒活性,结果显示重组Alb-CaIFN-α2的活性为1.70×10~6 U·mL~(-1),为进一步研究新型犬用干扰素制品奠定了试验基础。     

口蹄疫病毒3D基因在重组杆状病毒中的表达及检测

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒3D基因在Sf9细胞中的表达研究.首先克隆了3D基因片段,将pMD18-3D质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用EcoRⅠ及Xba Ⅰ酶切后,用T4DNA连接酶连接,构建了重组质粒pFastBac-3D;再将该重组质粒转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3D;将Bacmid-3D转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒,并进行表达水平的检测.经SDS-PAGE和West-ern blot检测,结果表明,3D蛋白在重组杆状病毒中获得表达.     

利用MultiBac系统表达有活性鸡γ干扰素及其鉴定

MultiBac系统是一套完善而又强大的真核表达系统,可在昆虫细胞中大量表达高品质的外源蛋白,已经应用于结构生物学研究和药物开发.为了实现鸡γ干扰素(chIFN-γ)在昆虫细胞中的表达,利用零背景转座技术构建重组杆状病毒,通过感染Sf9细胞,表达并且纯化chIFN-γ蛋白.使用制得的多抗血清,在重组杆状病毒感染的Sf9细胞样品中能够检测到大小为17.8 kD的单一条带,表明chIFN-γ成功表达.对纯化得到的重组chIFN-γ蛋白进行生物活性检测,结果显示其抗病毒活性为1.6×104 U/mL,具有良好的生物活性.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及其在重组杆状病毒中的表达

利用杆状病毒表达系统进行了口蹄疫病毒VP1基因在Sf9细胞中的表达研究。首先克隆了VP1基因片段．将pMD18-VP1质粒及杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ分别用BamHⅠ及Hind Ⅲ酶切后，用T4 DNA连接酶连接。构建了重组质粒pFastBac-VP1；再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌。在菌体内进行重组，并经三重抗性与蓝白斑筛选。得到杆状病毒重组质粒Bacmid-VP1；将Bacmid-VP1转染Sf9细胞．获得重组杆状病毒．并进行表达水平的检测。经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明，VP1蛋白在重组杆状病毒中获得表达。     

利用家蚕杆状病毒表达系统表达人γ干扰素及产物的抗病毒活性检测

干扰素-γ(IFN-γ)是免疫反应中重要的免疫调节因子,对多种免疫细胞具有激活作用.利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕中高效表达具有活性的人γ干扰素(hIFN-γ),首先根据家蚕密码子偏好性对hIFN-γ的编码基因进行优化合成,将优化合成后的序列克隆到杆状病毒转移载体pBR中,然后与orf1629基因缺失的失活拯救型杆状病毒BmBacmid共转染BmN细胞,获得重组病毒reBmBac-hIFN-γ,最后利用获得的重组病毒感染家蚕并收获表达产物.采用微量细胞病变抑制法,在Vero/VSV-GFP系统中检测到重组hIFN-γ 的效价达到(3.69±2.02)×106 IU/mL.此外,重组hIFN-γ可以抑制猪蓝耳病病毒(PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖.上述结果为利用家蚕生物反应器高效生产具有活性的人γ干扰素奠定了试验基础.     

奶山羊IL-1β在Sf9细胞中的表达

将CalL-1β基因整个编码区cDNA亚克隆到杆状病毒载体pFastBac-HTb中,构建转移载体pFastBac-HTb-CaIL-1β,转座到宿主菌DH10 Bac中,在Kan+/Gm+/Tet+/X-gal/IPTG LB平板上筛选白色菌落,碱裂解法提取质粒即为穿梭载体Baemid-CaIL-1β,转染Sf9细胞...     

非洲猪瘟病毒p30蛋白真核表达载体的构建及表达

本文设计特异性引物扩增全长p30基因,得到585bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac/NT-TOPO中,转化大肠杆菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有p30基因的真核表达载体。转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物20kDa,与预期大小一致,能与AFSV阳性血清产生特异性反应。     

表达H7亚型禽流感HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV/Restock/1/34(H7N1)1.7kbHA基因的cDNA克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4.5,筛选到重组质粒命名为rpBacHisH7HA。测序正确后,在脂质体介导下,与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rBacHisH7HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

蜂素信号肽介导猪干扰素-γ在杆状病毒中分泌表达及抗病毒活性检测

应用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统,将编码成熟的猪干扰素-γ基因插入供体质粒pFastBacTM1polyhedrin启动子控制下的多克隆位点,引入昆虫细胞可识别的蜂素信号肽(Honeybee melittin signal peptide)取代猪干扰素-γ原有信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化。将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体质粒,转染对数生长期的Sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。重组蛋白通过SDS-PAGE、间接免疫荧光、Western-blot证明在重组杆状病毒感染的昆虫细胞中获得分泌表达。通过在猪肾细胞(PK-15)上抑制水泡性口炎病毒(VSV)致病变作用检测重组蛋白的抗病毒活性是1.38×106U/mL。     

重组鸭干扰素的研发及其在鸭病防治中的应用

根据已发表IFN-γ序列,设计扩增一对IFN的引物,分离鸭脾脏淋巴细胞,提取m RNA,进行RT-PCR扩增,克隆鸭干扰素基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建供体质粒,进而获得重组Bacmid质粒,转染昆虫细胞,得到表达鸭IFN-γ的重组杆状病毒,重组杆状病毒感染昆虫细胞系生产鸭源干扰素;利用VSV-鸭胚成纤维细胞测定重组鸭IFN-γ抗病毒活性,试验验证重组鸭IFN体外抑制鸭源病毒的复制效果和对鸭病毒性疾病的防治作用,并进一步进行临床应用及推广试验,为批量生产安全高效新型抗鸭病毒干扰素奠定坚实基础。     

表达鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒的构建

参照Zadori等发表的鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)B株基因序列,设计合成了一对引物,扩增GPV VP3基因.将该基因克隆于转移质粒载体pFastBac/HBM-TOPO中,获得重组转移质粒pFastBac/HBM-TOPO-VP3,并将其转化入DH10Bac细胞中,得到重组穿梭质粒Bacmid-VP3,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-VP3,经PCR鉴定证实目的基因正确插入到杆状病毒基因组中.