瘤胃表皮葡萄球菌的分离鉴定及其β-葡聚糖酶基因的克隆和在乳酸球菌中表达的研究

为将瘤胃微生物纤维降解酶基因转化到乳酸菌中,从绵羊瘤胃内容物中分离到1株能够降解羧甲基纤维素钠的细菌,经过形态特征及细菌16SrDNA序列鉴定为表皮葡萄球菌。根据表皮葡萄球菌在GenBank中公示的β-葡聚糖酶基因序列设计PCR扩增引物,克隆到2个β-葡聚糖酶基因序列。将2个β-葡聚糖酶基因序列与载体pMG36e连接,构建β-葡聚糖酶基因表达载体,转化到大肠杆菌,并进一步转化到乳酸球菌MG1363,均能表达β-葡聚糖酶,表达酶活达1.47U/mL和1.54U/mL,比原表皮葡萄球菌酶活0.99U/mL高出1.49倍和1.56倍。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化

本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉（Aspergillus oryzae）。以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。结果显示：菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。     

大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因缺陷型菌株的筛选

本研究以大肠杆菌(含有β半乳糖苷酶基因)为试验对象，用氮-甲基-氮硝基氮-亚硝基胍对其进行诱导突变，在选择培养基上对突变体菌株进行筛选。结果成功地对鸡消化道共生乳酸菌进行了诱导突变，筛选到了β-半乳糖苷酶基因缺陷型的大肠杆菌受体菌株，从而为构建以β-半乳糖苷酶基因为选择标记的载体表达系统奠定了基础。     

椰果内生枯草芽孢杆菌YZ-21甘露聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

为了提高β-甘露聚糖酶的活性及稳定性,通过基因克隆技术克隆并表达了一株分离自椰果的内生枯草芽孢杆菌YZ-21(Bacillus subtilis YZ-21)β-甘露聚糖酶基因ManA,并使用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定了酶活性及稳定性。结果表明：β-甘露聚糖酶基因ManA序列全长1 104 bp,与相同来源的β-甘露聚糖酶同源性高达97.56%,具有ManA保守结构域,符合糖苷水解酶家族GH26的典型特征。将ManA连接到pET-32a表达载体上,构建重组表达质粒pET-ManA,并导入大肠杆菌BL21(DE),经诱导获得了β-甘露聚糖酶基因ManA的高效表达。表达产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳分析,显示条带大小约为56.07 ku。重组酶活性为372.86 U/mL,酶学性质研究发现其最适反应温度为40℃,最适pH为7.0,最佳反应底物是瓜豆胶,酶活性能够达到392.54 U/mL。在55℃处理120 min后,酶活仍保留69.8%,pH为4.0～9.0时处理30 min后酶活性均能保留60%以上,且金属离子Ca²⁺、Co     

中性植酸酶的克隆、表达、纯化及酶学性质研究

基于454高通量测序枯草芽孢杆菌I4全基因组,获得一个编码中性植酸酶的基因Bpp,该基因全长为1 149 bp,编码382个氨基酸组成的多肽,成熟蛋白的理论相对分子质量为42 590.将基因Bpp克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠杆菌BL21( DE3)中表达,表达产物具有植酸酶活性,利用组氨酸标签纯化并初步研究其酶学性质.结果表明:酶作用的最适pH为7.5,最适温度为55℃,Km为38.76 mmol/L,Vmax为2.34 U/mg,比活力为6.054 U/mg,中性植酸酶活性依赖Ca2+.     

2个枯草芽孢杆菌源纤维素酶基因的克隆、融合表达及其酶学性质分析

本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn~(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg~(2+)和Cu~(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。     

葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因密码子的优化及表达

[目的]合成经过密码子优化的葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶基因,并将2个基因在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)中进行分泌表达。[方法]对瘤胃真菌(Piromyces rhizinflatus,P.rhizinflatus)的外切葡聚糖酶cbhYW23-1基因(Gen Bank登录号:EU314937.1)和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes,F.succinogenes)的内切葡聚糖酶end-1基因(Gen Bank登录号:X88561.1)进行L.lactis MG1363密码子偏爱性优化,并在2个基因的上游和下游分别引入ClaⅠ/XbaⅠ和Hind Ⅲ酶切位点,得到含有优化的cbhYW23-1基因和end-1基因的克隆载体p UC57-cbhYW23-1和p UC57-end-1;通过酶切后分别连接到构建的组成型分泌载体p MG36e+P32+SPusp45上,得到2个基因的表达载体,然后电转至L.lactis MG1363中,利用红霉素抗性筛选得到高拷贝转化重组子;以CMC-Na(羧甲基纤维素钠)为底物验证其活性及表达情况。[结果]成功地构建了cbhYW23-1基因和end-1基因的分泌型表达载体,2个基因均能够在L.lactis MG1363中高效稳定表达,2株重组菌株表达的外切葡聚糖酶酶活和内切葡聚糖酶酶活分别为118.80 U/mL和294.32 U/mL。[结论]密码子优化后的2个纤维素酶基因在L.lactis中获得理想稳定的表达,其高效基因工程菌的构建为将来实现这2种纤维素酶的工业化生产奠定了技术基础。     

海栖热袍菌耐热葡聚糖内切酶EG12B基因的克隆表达及酶学特性分析

为了促进家畜对纤维素饲料的消化吸收,提高饲料利用率,改善畜产品品质,本研究基于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的基因组信息,通过筛选获得一段具有潜在耐热特性的葡聚糖内切酶基因(EG12B)序列。经删除预测信号肽和优化密码子偏好性,运用基因工程手段将成熟肽EG12B基因克隆至原核表达载体pET-28a中,成功构建了重组表达质粒pET28-EG12B。转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经重组菌发酵培养及IPTG诱导表达,实现了EG12B在大肠杆菌系统中的胞内高效表达,表达量约占全细胞总蛋白的36%。通过细胞超声破碎、镍离子亲和层析以及热处理分离纯化,获得了电泳纯重组酶EG12B。酶学特性分析表明,该重组酶的最适反应温度为90℃,最适反应pH为5.2,在70℃下保温1 h,酶活力基本维持不变。表明葡聚糖内切酶EG12B具有优越的耐热性和良好的热稳定性,为进一步作为饲料添加剂用于纤维素饲料关键技术的开发和畜产品品质的提升奠定了理论基础。     

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。     

复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株

以黑曲霉SD16为出发菌株,经紫外线和N 注入诱变处理,选育高产β-萄聚糖酶菌株.结果表明:紫外线的最佳照射时间为10min,N 最佳注入剂量为70×2.6×1012 N /cm2;突变高产菌株AN1的β-葡聚糖酶酶活由出发菌株SD16的493.2 U/mL提高到902.5 U/mL.且突变菌株AN1经传5代培养,产酶性能稳定.     

红树林耐糖β-葡萄糖苷酶产生菌的分离鉴定及发酵条件优化

研究旨在筛选具有优良特性的β-葡萄糖苷酶产生菌，为微生物β-葡萄糖苷酶制剂的开发提供理论依据。研究以微晶纤维素为唯一碳源，从海南省东寨港红树林腐殖层土壤中筛选到一株β-葡萄糖苷酶高产菌J1，鉴定为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）。研究发现聚多曲霉J1在以葡萄糖为唯一碳源条件下可以产β-葡萄糖苷酶，故对β-葡萄糖苷酶的性质进行了探讨，并采用响应面法在摇瓶发酵水平对聚多曲霉J1产β-葡萄糖苷酶的发酵条件进行优化。结果表明，该酶的最适反应温度和最适反应pH分别为60℃和5.0，葡萄糖抑制常数IC₅₀高达178.5 mmol/L；通过响应面法获得该菌的最佳产酶条件为碳源浓度1%、氮源浓度0.5%、pH 8.05、接种量5.02×10⁶个/mL，培养温度28.7℃，摇床转速160 r/min，装液量100 mL/250 mL，该条件下酶活达3.37 U/mL，较优化前酶活提高了333.6%。聚多曲霉分泌的β-葡萄糖苷酶具有较好的葡萄糖耐受性，在饲用酶制剂方面的应用具有较大潜力。     

黄色瘤胃球菌木聚糖酶基因xynB的异源表达与酶学性质研究

该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明,XynB理论大小为47 kDa,预测等电点为4.49,不含信号肽,含有1个糖苷水解酶11家族结构域和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明,该酶的最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,金属离子Mg²⁺、Na⁺、K⁺和Ba²⁺对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知,黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族,最适pH值为5.0,最适温度为40℃,酶比活力为62.94 U/mg。     

木聚糖酶和纤维素酶多酶嵌合体的构建

为探究木聚糖酶和纤维素酶形成的多酶嵌合体降解纤维素的效果,此研究设计了2个含有不同来源锚定域的重组木聚糖酶基因和重组纤维素酶基因,并设计了含有2个不同来源的粘附域和纤维素结合域的脚手架蛋白基因,体外构建了大肠杆菌E.coil BL21(DE3)表达载体,表达纯化了脚手架蛋白、重组木聚糖酶和纤维素酶。同时,体外组装三种元件形成多酶嵌合体,以微晶粉末纤维素为底物检测其降解纤维素的效率。结果显示,纯化所得的脚手架蛋白Scaf、重组木聚糖酶Xyn10B和纤维素酶Cel48F可在体外组装形成多酶嵌合体,该多酶嵌合体酶活(0.107±0.013 U/mL)显著高于游离酶混合物的酶活(0.084±0.001 U/mL)(P0.05)。试验表明木聚糖酶Xyn10B和纤维素酶Cel48F可与脚手架蛋白Scaf体外组装形成多酶嵌合体,并可实现对纤维素的高效降解。     

耐热性α-半乳糖苷酶突变体的筛选及酶学性质研究北大核心

研究旨在改造株链球菌来源的α-半乳糖苷酶基因Gal_(2)7A,获得耐热性高的突变体。在常规PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2),将基因克隆至载体pGAPZαA并成功构建表达酶产物的重组质粒pGAPZαA-Gal_(2)7A。将线性化的重组质粒电转至毕赤酵母GS115,在含有100 g/L博来霉素的YPDS平板上筛选耐热性提高的突变体,通过pNPG的方法测定重组酶的酶学性质为最适温度65℃,最适pH值6.5,Ag^(2+)、Hg^(2+)对重组酶的酶学活性具有明显的抑制作用,Cu^(2+)对重组酶的酶活性具有促进作用。研究表明,试验成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株29和54,在55℃保温10 min与同等条件下的野生型进行对比,加热前后的保留酶活比的增幅大于45%。     

无机铜/蒙脱石纳米材料对肉鸡生长、肠道菌群和细菌酶活的影响

本试验以1日龄AA商品代混合雏鸡为试验动物,探讨无机铜/蒙脱石纳米材料(ICMN)对肉鸡生长、肠道菌群和细菌酶活性的影响。结果表明:饲料中添加1￣2g/kgICMN,可以明显地促进肉鸡生长和改善饲料利用效率。ICMN能降低肠道大肠杆菌和产气荚膜梭菌数,抑制肠道β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酸酶的活性,但对肠道总厌氧菌、总需氧菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数未产生显著影响。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因双拷贝工程菌株的构建与发酵研究

本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。     

淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyrlolique faciens)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因全长。结果显示，该基因全长843 bp，ORF为717 bp，编码239个氨基酸，计算相对分子质量为26800，等电点为6．07。经Blast分析，该序列与基因库中的淀粉液化芽孢杆菌(M15674)同源性最高(97％)。该基因已被GenBank接受(AY205562，1)。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切目的片段和表达栽体pET-30a( )后相连接，构建了重组表达栽体pETamy，并导入BL21细菌中表达，酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在26000左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达90．74U／mL，是出发菌的3倍，最适温度在60℃左右，pH值在4～10之间。该工程菌可作为酶活高的理想材料，用以构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的构建及表达

为了构建含大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)与产气荚膜梭菌β1、β2毒素融合基因的表达菌株,试验将亚克隆LTB基因融合到β2-β1毒素基因的上游,构建了pET30a-LTB-β2-β1原核表达载体,经IPTG诱导表达,对其表达产物进行SDS-PAGE检测和Western-blot分析。结果表明:重组菌株可以表达LTB-β2-β1融合蛋白,且该融合蛋白可以被相应的抗体识别。     

枯草杆菌的淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

根据枯草杆菌(Bacillus subtilis)基因文库中的淀粉酶基因的碱基序列,设计引物。以枯草杆菌菌体DNA为模板,利用PCR扩增出分子量大约为2.3 kb的淀粉酶基因片段。借助于核酸内切酶和连接酶把该基因植入到pHMSXD1质粒中,构建pHMSXD2质粒载体。通过高压电击处理把载体植入到大肠杆菌(JM10)中并成功表达。该株大肠杆菌在酶基因表达后,其淀粉酶活力达到1.037 6 U/mL(LB培养液)和1.361 0 U/mL(矿物元素培养液),分别比原始的枯草杆菌的淀粉酶活力提高了46倍和286倍。     

新疆多浪羊pcDNA3.1-IL-1β表达载体的构建及鉴定

为了构建新疆多浪羊真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,试验采用重组质粒p MD-18TIL-1βPCR和质粒pc DNA3.1双酶切的方法,获得目的基因白细胞介素-1β(IL-1β)和载体片段pc DNA3.1(+),通过连接、转化宿主菌大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,再通过菌液PCR和双酶切来验证阳性克隆,并测序。结果表明:试验已成功构建真核表达载体pc DNA3.1-IL-1β,完成了pc DNA3.1-IL-1β的菌液PCR和酶切鉴定。通过对IL-1β功能的了解,以及熟悉质粒提取和质粒连接的方法,完成重组质粒pc DNA3.1-IL-1β的构建。