芋螺毒素Lv68的一步氧化及其对乙酰胆碱受体的阻断活性

本研究通过固相合成法合成芋螺毒素Lv68线性肽,研究并优化了其主要异构体的一步氧化折叠条件,并通过电压膜片钳技术对主异构体产物进行了多种乙酰胆碱受体亚型（α3β4,α6β4,α4β2,α9α10,α1β1γδ,α1β1δε nAChRs）的活性测试,旨在为以烟碱型乙酰胆碱受体为靶点的先导药物分子的发现奠定基础,同时为该类其他芋螺毒素的氧化折叠方法、生物活性研究以及深入开发利用提供参考和借鉴。结果表明,芋螺毒素Lv68的一步法氧化折叠最优条件为反应体系组成为0.1 mol·L?1 Tris-HCl,1 mmol·L?1 EDTA,GSH/GSSG 1 mmol·L?1/1 mmol·L?1,线性肽浓度为50 μmol·L?1,反应时间为2 h,产率高达18.14 %,Lv68折叠肽在1 μmol·L?1浓度下对α9α10 nAChR具有较好的阻断作用（阻断率约80%）。本研究明确了芋螺毒素Lv68的一步氧化折叠条件,证实了Lv68对α9α10乙酰胆碱受体亚型具有阻断活性,拓宽了含半胱氨酸框架III的M超家族芋螺毒素的作用靶点范围。     

α-芋螺毒素TxID对肺癌的细胞毒性

对α-芋螺毒素TxID在小细胞肺癌DMS114中的细胞毒性进行研究。使用两步氧化法对α-芋螺毒素TxID进行合成,质谱鉴定TxID,并通过高效液相色谱(HPLC)确定其纯度;对DMS114中的α3和β4 nAChR亚基进行克隆;使用MTT试验检测α-芋螺毒素TxID单用或与阿霉素(ADM)联用对DMS114和HEL细胞的细胞毒性作用。本实验通过固相合成和两步氧化法,成功制备了α-芋螺毒素TxID;通过基因克隆实验,在DMS114细胞中检测到α3和β4 nAChR亚基;细胞毒性试验表明α-芋螺毒素TxID对肺癌细胞DMS114和正常细胞HEL都具有细胞毒性且在一定浓度TxID对肺癌细胞的毒性大于正常细胞;此外,TxID和ADM等比联用对DMS114细胞的毒性大于各自单独给药之和。本研究首次证明α3β4 nAChR特异性阻断剂α-芋螺毒素TxID能够抑制小细胞肺癌DMS114的增殖并具有细胞毒性作用,可为新型抗癌药物的研究与开发提供指导。     

α6/α3β4乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体（α6β4* nAChRs,*代表其他亚基）主要分布于大脑海马区、外周神经节和人源肾上腺嗜铬细胞等,与神经性疼痛和炎症反应、情绪等生理疾病密切相关。本研究拟对大鼠α6/α3β4 nAChR在非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞膜上进行重组表达,并利用双电极电压钳电生理学技术检测该重组受体的功能。在不同浓度的激动剂乙酰胆碱的刺激下,比较了α6/α3和β4亚基的不同配比形成的受体通道开放而产生的电流大小,并用其拮抗剂α?芋螺毒素TxID验证了该受体的敏感性。结果表明,亚基不同配比的α6/α3β4 nAChR均可在非洲爪蟾卵母细胞膜上成功表达,并具有较好的配体门控敏感性。     

小菜蛾nAChR靶标敏感性与沙蚕毒素类药物的抗性关系

【目的】研究抗杀虫双、杀螟丹和溴氰菊酯品系的神经乙酰胆碱受体及与它们对沙蚕毒素类药物的抗性间的关系。【方法】测定不同品系小菜蛾的神经乙酰胆碱受体与125I标记的α-银环蛇毒素的结合率。【结果】抗杀虫双、杀螟丹品系小菜蛾的神经乙酰胆碱受体对沙蚕毒素药物有显著的靶标不敏感性,它们与配体的结合率大约分别是敏感品系的66%和60%,在溴氰菊酯抗性品系中没有明显变化。【结论】神经乙酰胆碱受体对杀虫剂敏感性下降可能是小菜蛾对沙蚕毒素药物产生抗性的一种作用机理。     

芋螺毒素研究现状

从芋螺毒素的结构特点、分类及作用机理3个方面综述了芋螺毒素的研究现状,并对其应用前景进行了展望。     

热带特色海洋药物研究团队

正简介|Brief|海南大学海洋学院热带特色海洋药物研究团队是教育部创新团队,该团队紧密围绕热带特色海洋药物芋螺毒素资源,综合利用生物学、药学、化学、电生理学、医学等多个交叉学科门类的先进技术方法,开展热带特色药用海洋生物芋螺资源的保护、基因库构建、新毒素大量发现、药用芋螺毒素筛选鉴定、构效关系研究、成药性评价及创新药物研发等工作,以获得具有自主知识产权的重大海洋新药先导药物和临床药物为长远目标,揭示海洋药物的发现、活性筛选及合成生产一系列过程中的客观规律,进行开创性探索研究,期望产生海洋新药研制的关键技术创新和集成创新。芋螺毒素被誉为"海洋药物宝库"和"尚未开     

α6/α3β4烟碱型乙酰胆碱受体β4亚基双点突变体的制备及其功能研究

在烟碱型乙酰胆碱受体家族中,含α6亚型的受体是比较特殊的一类。研究发现α6β4*亚型(*表示含其他亚基)在神经系统方面具有一定的调节作用,与神经性疼痛、成瘾等多种疾病的发病机制密切相关,可作为潜在的治疗靶点。比对大鼠与人类α6和β4亚基的序列,以野生型基因为模板,采用基因定点突变的方式,成功得到3种相邻位点突变的α6/α3β4受体突变型基因。通过体外转录、显微注射等手段,构建α6/α3β4受体野生型和突变型在非洲爪蟾卵母细胞上的表达模型,并使用双电极电压钳检测受体的表达情况。结果表明,与野生型受体相比,突变体α6/α3β4[S52N, I53V] 对ACh的敏感性有所提升,EC₅₀为59.58 μmol·L?1,是野生型的1/2,而其他两种突变体的敏感性与野生型相同。     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

常见植物源杀虫剂及其应用技术

1 烟碱 烟碱是一种具有高度挥发性的神经毒剂型杀虫剂,其作用靶标为神经突触后膜上的烟碱型乙酰胆碱受体.对昆虫的作用机理主要表现为熏蒸、触杀、胃毒以及抑制生长发育的作用,并有一定的杀卵活性.     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA片段的克隆和序列分析

利用简并引物，采用PCR等分子生物学技术，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)α亚基的cDNA片段进行克隆，并对序列进行分析。测序结果显示，扩增的目的基因片段包含了nAChRα亚基的3种亚型（分别命名为Pxαl，Pxα2，Pxα3）。都具有典型的α亚基的结构；2个相邻的半胱氨酸，由2个半胱氨酸之间二硫键形成包含15个氨基酸的胞外环，与烟碱和α银环蛇毒素结合有关的氨基酸残基，克隆的基因片段在氨基酸序列上和其他昆虫nAChRα亚基基因之间有高达65%-99%的同源性，表明克隆的cDNA片段是小菜蛾nAChRα亚基基因的部分序列。     

牡丹品种间花瓣营养成分差异

以牡丹Paeonia suffruticosn‘乌龙捧盛“白雪塔“迎日红“俊艳红“春红娇艳“万世生色’等6个品种的花瓣为材料,分析其中维生素C、粗蛋白、类黄酮、氨基酸和9种矿物元素的质量分数。结果表明：品种间类黄酮、维生素C、粗蛋白的质量分数存在较大差异,‘乌龙捧盛’中这3种营养成分质量分数均最高,分别为13．08mg·g-1,1．12mg·g-1,0．11g·g-1;花瓣所含氨基酸种类齐全,不同氨基酸质量分数存在差异,质量分数最高的是谷氨酸（9．64～15．83mg·g-1）,最低的是半胱氨酸（0．15～0．86mg·g-1）;牡丹花瓣中富含多种矿质元素,其中微量元素硒的质量分数较高。不同品种间营养成分含量差异较大,品种‘乌龙捧盛’类黄酮、粗蛋白、维生素C、总氨基酸和钾、钙、镁、铁、铜等元素质量分数均较其他品种高．具有较高的营养价值。图3表2参14     

广西鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank上已发表的东北白鹅α干扰素（IFN-α）基因（AY524422）序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR从经鹅副粘病毒（GPMV）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞中克隆获得广西鹅IFN-α基因,将其连接pMD18-T载体、转化DH5α感受态细胞后进行序列分析.结果表明,广西鹅IFN-α基因完整的开放阅读框大小为576 bp,共编码192个氨基酸残基,其推导的氨基酸中有7个半胱氨酸残基和2个潜在的糖基化结合位点（NDT和NHT）.与GenBank上已公布的其他IFN-α基因进行同源性比较分析,发现广西鹅IFN-α基因与东北白鹅的同源性最高（核苷酸同源性为98.3%、氨基酸同源性为96.4%）,与鸡、牛、猪、鼠、犬、人等的同源性较低.说明IFN具有种属特异性,且亲缘关系越近同源性越高,这与物种之间的进化亲缘关系一致.     

西加毒素检测分析研究新进展

西加毒素是一种属于获得性毒素的珊瑚鱼毒素,为脂溶性多聚醚类化合物,有强烈的和不可逆的胆碱酶抑制毒性。从发现西加毒素至今,有不同的检测方法提出,但都不能满足适应市场的需求。主要对西加毒素现有的检测分析方法进行了综述,将有助于多种检测方法更好地提高与完善,对于西加毒素中毒防治、水产业的顺利发展以及公众的健康都具有重要意义。     

斑马鱼g型溶菌酶基因序列分析及其原核表达

【目的】实现斑马鱼g型溶菌酶在大肠杆菌中表达,以获得高纯度且具溶菌活性的融合蛋白,为探究g型溶菌酶在斑马鱼抗菌过程中的作用机制及其开发利用打下基础。【方法】通过ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在线软件对斑马鱼g型溶菌酶进行生物信息分析,经密码子优化后合成斑马鱼g型溶菌酶基因,亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以IPTG进行诱导表达,并通过非干扰型蛋白浓度测定试剂盒和溶菌酶测定试剂盒（比浊法）测定其浓度及溶菌活性。【结果】从GenBank检索获得的斑马鱼溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分别命名为Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因开放阅读框（ORF）长591 bp,共编码196个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF长576 bp,共编码191个氨基酸残基,其编码蛋白分子量约21.1 kD;2种斑马鱼g型溶菌酶序列中均含有2个半胱氨酸残基及3个保守的催化残基位点（Glu、Asp和Asp）。Zeb-Lys-g1的N端含有17个氨基酸的信号肽,而Zeb-Lys-g2不存在典型的信号肽结构,但其三级结构均具有多个α-螺旋结构。在基于溶菌酶序列相似性构建的系统发育进化树中,Zeb-Lys-g1序列与金鱼g型溶菌酶序列的亲缘关系最近,而Zeb-Lys-g2序列与鲈形目和鲽形目鱼类的g型溶菌酶序列亲缘关系较近。将合成的斑马鱼g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亚克隆至pET-28a（+）表达载体并转化BL21（DE3）感受态细胞,20 ℃下经IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导16 h,可获得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2,纯化后的浓度分别为1.01和1.66 mg/mL,对应的溶菌活性分别为689.68和44.39 U/mg。【结论】鱼类g型溶菌酶的基因变异较保守,经密码子优化及全基因合成方式合成的斑马鱼g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通过原核表达获得高纯度、高溶菌活性的融合蛋白,为探究斑马鱼溶菌酶的抗菌机制提供了技术支持。     

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。     

传染性法氏囊病病毒河南分离株（HN04）A片段cDNA的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,以传染性法氏囊病毒河南分离株(HN04)基因组RNA为模板,扩增并克隆IBDV HN04株基因组A片段cDNA。测序结果表明:克隆的A片段全长3260个核苷酸,包括2个部分重叠的开放阅读框(ORFl和ORF2)及两端的非编码区。ORFl和ORF2分别编码含有1012个氨基酸的结构蛋白(VP2-4-3)及含有145个氨基酸的VP5。IBDV HN04株基因组A片段核苷酸序列与来自GenBank IBDV血清Ⅰ型毒株核苷酸序列的同源性高达94.9%～99.4%,血清Ⅱ型毒株核苷酸序列同源性为83.8%。对IBDV HN04株的A片段核苷酸及其推导氨基酸进行序列分析,结果显示HN04株与国内外IBDV数株弱毒株的同源性在99.0%以上。     

四川小麦地方品种AS1643中α/β醇溶蛋白基因

用PCR方法从四川小麦地方品种AS1643中克隆到3个α/β-醇溶蛋白基因，即Gli-AS1643-1（GenBank No.DQ166376）、Gli-AS1643-2（GenBank No.DQ166377）和Gli-AS1643-3（GenBank No.DQ166378）。其中，Gli-AS1643-1和Gli-AS1643-2的编码区长度分别为873bp和852bp，可编码270和263个氨基酸残基的成熟蛋白。Gli-AS1643-3由于在编码区内有一个提前终止密码子，为不可编码成熟蛋白的假基因。序列比较显示Gli-AS1643-1、Gli-AS1643-2和 Gli-AS1643-3分别与GenBank中的α/β-醇溶蛋白基因具有较高的一致性，且序列结构非常相似。它们的N-端氨基酸序列与各种α-、β-、γ-和α/β-醇溶蛋白的基本一致，但与ω-醇溶蛋白和低分子量谷蛋白亚基的明显不同。N-端12肽串联重复紧密相关的5个脯氨酸框和类似于微卫星序列编码的2个多聚谷氨酰胺区域。在Gli-AS1643-2的N-端存在腹泻疾病活性序列，C-端含有12型腺病毒感染序列。Gli-AS1643-1、Gli-AS1643-2和Gli-AS1643-3各由6个保守的半胱氨酸残基形成3个分子内二硫键。     

酸豆乳中不同营养物的添加效果研究

为考察单糖类（葡萄糖）、双糖类（蔗糖和乳糖）、低聚糖类（低聚果糖）、维生素类（盐酸硫胺VB,和维生素C）,氨基酸类（半胱氨酸）等添加物对乳酸菌在豆浆中的增殖情况的影响,通过感官评价（凝固时间,凝固后的色泽、状态,乳清析出时间）以及对发酵乳的特性（滴定酸度、pH值、美兰褪色时间、粘度）的研究比较不同营养物的添加效果。结果表明：VB,对酸豆乳滴定酸度的提高效果最为明显：低聚果糖对于减小乳酸菌发酵产物pH值效果较为明显：添加了葡萄糖、乳糖和低聚果糖的酸豆乳凝乳状态好。     

山海关杨PdERF-18转录因子的表达特征分析

对一个溃疡病茼Botryosphaeria dothidea胁迫相关的山海关杨Populus deltoides‘Shanghaiguan’乙烯反应因子（ethylene responsive factors,ERFs）基因——PdEh’F-18基因的系统发育、编码产物结构以及多种胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明：PdERF-18基因编码产物属于ERF转录因子家族B-6类群,具有植物ERF转录因子的典型结构,但它与转录调控功能密切相关的AP2／ERF结构域第19位氨基酸位点发生替换,推测PdERF-l8基因可能具有不同于其他典型ERF转录因子的功能;实时定量分析表明：溃疡病茼、根癌农杆茼Agrobacteriumtumefaciens（Rhizobiumradiobacter）,脱水、机械胁迫、盐胁迫和高温处理、莱莉酸以及水杨酸处理均可诱导Pr,ERFl8基因的上调表达。其中溃疡病茼与莱莉酸处理以及根癌农杆茼与水杨酸处理下,杨树Pr／ERF-18基因分别具有相似的表达特征,显示溃疡病茼、根癌农杆茼侵染的信号转导可能分别与莱莉酸／乙烯途径、水杨酸信号传导途径有关。Pr,ERFl8基因可以对多种非生物、生物胁迫产生响应,Pr／ERF-18基因有可能作为一种新的遗传资源而应用于杨树抗性遗传改良。图4参30