广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析

为进一步研究鹅干扰素（IFN）的分子生物学特性及抗病毒作用机理,提取经刀豆素（ConA）刺激培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增获得鹅IFN-γ基因,将其克隆至pMD18-T载体并进行序列测定分析。结果表明,克隆获得的广西鹅IFN-γ基因与GenBank上已公布的鹅IFN-γ基因核苷酸序列的同源性均高于99.2%、氨基酸同源性均高于98.2%;与其他动物的IFN-γ基因核苷酸及氨基酸序列比较,亲缘关系越远,同源性越低。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析*

 根据GenBank中鸡α干扰素（IFN-α）基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序。结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基。3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9％。克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间。     

3个品种鸡α干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中鸡α干扰素(IFN-α)基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从鸡肝组织基因组中扩增罗曼鸡、海兰鸡及固始鸡α干扰素基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了3个品种鸡IFN-α全基因序列,长度均为582bp,编码193个氨基酸残基.3个品种鸡IFN-α基因及推导的氨基酸序列比较结果显示,海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因序列完全一致,而固始鸡与海兰鸡和罗曼鸡IFN-α基因核苷酸同源性99.3%,有4个碱基发生非同义变异,氨基酸同源性为97.9%.克隆的3个品种鸡IFN-α基因序列与GenBank上发表的7条鸡IFN-α基因序列进行比较分析发现,核苷酸同源性在98.1%～100%之间,氨基酸同源性在96.9%～100%之间.     

京巴犬α-干扰素全基因的克隆与分子进化分析

根据基因库(CenBank)中收录的犬α-干扰素(IFN-α)基因核苷酸序列(AB102731),设计并合成了1对引物,PCR扩增京巴犬IFN-α全基因,并克隆、测序.结果表明,犬IFN-α基因全基因序列为564 bp,包含1个开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸.序列比较分析发现,京巴犬IFN-α基因序列与GenBank发表的其它品种犬IFN-α基因序列核苷酸同源性为96.3%以上,氨基酸同源性为94.1%以上,其中与AB102731核苷酸同源性最高,为99.5%.仅有3个碱基差异.京巴犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.京巴犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

四川白鹅白细胞介素-2基因的克隆及生物信息学分析

[目的]克隆分析四川白鹅白细胞介素-2(IL-2)基因。[方法]参照GenBank中发表的鸭IL-2基因保守序列,设计1对引物,采用RT-PCR技术从ConA刺激的四川白鹅外周血淋巴细胞的总RNA中扩增鹅IL-2基因,并进行测序及生物信息学分析。[结果]四川白鹅IL-2基因全长468 bp,含1个441 bp的开放阅读框(ORF),编码146个氨基酸。生物学软件分析表明该序列编码的氨基酸序列中有4个磷酸化位点,1个糖基化位点,含有21个氨基酸残基组成的信号肽。同源性分析表明四川白鹅IL-2基因与鸭、鸡和火鸡IL-2核苷酸及氨基酸序列同源性均分别为92.2%、77.5%、78.2%和85.8%、65.5%、64.1%,而与其他种属的哺乳动物及啮齿类动物(如人、猴、大鼠、牛、马、猪、猫、小鼠、兔和鹿)的IL-2基因的核苷酸和氨基酸同源性均分别低于45%和28%。[结论]四川白鹅IL-2基因与鸭和鸡具有较近的亲缘关系。     

籽鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

运用RT-PCR方法,获得籽鹅脑垂体催乳素（Prolactin,PRL）基因编码区序列cDNA,克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明,PRL cDNA全长690 bp,编码230个氨基酸残基,与皖西白鹅的碱基同源性达99.57%,氨基酸同源性达99.56%。将所得序列与表达载体pET-32 a（＋）构建表达质...     

水貂α-干扰素基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法从体外诱导的水貂外周血淋巴细胞中扩增出水貂的α-干扰素基因(MiIFN-α)。测序结果显示,水貂的IFN-α基因序列全长为564个核苷酸,共编码187个氨基酸,与GenBank上已发表的雪貂的IFN-α核苷酸序列同源性为97.5%,氨基酸同源性为92%。     

吉林白鹅α干扰素基因的克隆与序列分析

从吉林白鹅(Anser cygnoides)肝脏组织提取基因组DNA,应用Primer 5.0软件设计一对加入EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的特异性引物,PCR扩增得到α干扰素基因(IFN-α),将PCR产物克隆至pMD18-T克隆载体,转化DH5α感受态细胞,挑取阳性菌落进行鉴定和测序.结果表明,IFN-α已被成功克隆.序列分析结果显示该基因序列与GenBank中已知的狮头鹅(A.anser)lFN-α序列(登录号HQ009755)同源性为99.5％.     

鹅LPL基因外显子4、5、6克隆及序列分析

为揭示鹅脂蛋白脂酶(LPL)脂质和肝素结合区域的特性,对鹅LPL基因外显子4~6进行了克隆和序列分析。以皖西白鹅血清总DNA为模板,设计引物对鹅LPL基因的第4~6外显子区域进行扩增和测序,分析鹅与其他物种之间该区域的DNA序列同源性、密码子非随机应用以及相应氨基酸残基区域的亲水性。结果表明,鹅LPL基因外显子4~6的片段大小分别为112、234和243 bp,其序列与鸡LPL基因相应序列的同源性达到91.9%,与人、羊、牛、猪等哺乳动物的同源性为74%~77%;鹅与鸡密码子非随机应用的相似系数为0.839,与猪和鼠的相似系数为0.580~0.650;LPL中由外显子4~6编码的氨基酸残基有4个区域具有较大的表面概率,分别位于残基145~148、残基187~190、残基255~257和残基293~299区域,表面概率分别1.62~4.29、2.06~3.01、2.75~4.46和3.03~6.01,这些区域伴随有较强的亲水性。     

11株禽多杀性巴氏杆菌OmpA基因克隆测序及其序列分析

为了解国内禽多杀性巴氏杆菌流行株（Pasteurella multocida,Pm）OmpA基因的变异情况,参考GenBank中已发表的多杀性巴氏杆菌序列设计一对特异性引物,采用PCR方法对11个禽Pm菌株和3个荚膜型参考株（A,B,D）的OmpA基因进行扩增,将各菌株纯化回收的扩增产物与pMD18-T载体连接,筛选阳性克隆进行测序。结果表明：14个菌株的OmpA基因开放阅读框在1 047～1 077 bp之间,其中长度为1 062 bp的有9个菌株;Signal IP 4.0预测表明,信号肽均为N端21个氨基酸残基,成熟蛋白氨基酸残基数量在327～332之间,推测的分子量为35.19～36.35 kD。与GenBank中12个菌株OmpA基因核苷酸序列比对及遗传进化分析发现,核苷酸同源性为85.3%～100%;氨基酸同源性为83.1%～100%;其中C48-1,1010,9003,890920,921012,xj等6个国内禽Pm分离株OmpA序列同源性为100%。由此可见国内禽Pm菌株OmpA基因非常保守。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

贵宾犬α-干扰素基因的扩增、克隆与序列分析

参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。     

麻鸭γ-干扰素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术,直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取的总RNA中扩增出麻鸭γ-干扰素基因(duIFN-γ),并克隆、测序。测序结果表明,麻鸭IFN-γ全序列大小为515 bp,包含一个完整阅读框(495 bp),编码164个氨基酸残基,推导的氨基酸有3个潜在的N-糖基化位点,有5个与二硫键形成有关的半胱氨酸。麻鸭IFN-γ基因序列与AF087134、AF100929、AJ012254的序列完全一致,而与北京鸭(AY166850)核苷酸同源性为99.6%,有2个碱基差异,为非同义突变,氨基酸同源性为98.8%。麻鸭IFN-γ基因与鸡、火鸡和鹌鹑IFN-γ基因核苷酸序列同源性分别为77.2%、78.0%、78.8%,氨基酸序列同源性均67.1%,而与人、狒狒、猪、牛、绵羊、犬、猫IFN-γ核苷酸序列同源性为39.7%～42.1%,氨基酸序列同源性在28.0%～31.7%之间。     

我国首次克隆到水貂α干扰素基因亚型

中国农业科学院特产研究所野生动物人兽共患病研究室应用RT-PCR方法从体外诱导的水貂外周血淋巴细胞中扩增出水貂的α干扰素13种基因（MiIFN-α）亚型。13种基因亚型基因序列全长均为564bp,编码187个氨基酸。亚型间核苷酸同源性为93．8％-99．3％,氨基酸同源性为88．3％-97．9％。GenBank登录号分别为：IFN-α1（EU863613）、IFN-α2（EU863614）、IFN-α3（EU863615）、IFN-α4（EU863616）、     

地方品种固始鸭与樱桃谷鸭α-干扰素基因的克隆与遗传进化分析

根据GenBank发表的鸭α-干扰素(interferon-alpha,IFN-α)基因序列(AY879230),设计并合成了1对引物,提取固始鸭和樱桃谷鸭基因组DNA,应用PCR技术扩增地方品种固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,并克隆、测序.测序结果表明获得了固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因,大小均为584 bp,包含1个IFN-α基因完整的开放阅读框,编码191个氨基酸的多肽.推导的氨基酸有2个潜在的 N-糖基化位点,有7个与二硫键形成有关的半胱氨酸.克隆的固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与北京鸭IFN-α基因的氨基酸序列比较,仅固始鸭IFN-α基因发生突变D38N.固始鸭和樱桃谷鸭IFN-α基因与其他IFN-α基因的氨基酸序列遗传进化树分析表明樱桃谷鸭与北京鸭有很近的亲缘关系,固始鸭次之.地方品种固始鸭在非常保守的38位发生了氨基酸突变,推测这可能与该品种鸭具有很强的抗病能力有关.     

犬瘟热病毒水貂分离株H基因的遗传多样性分析

以犬瘟热病毒水貂分离株的RNA为模板,对分离株的H基因进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后与pMD-18T Sim-pie Vector连接,成功地构建了克隆质粒pMD-18T-CDVH.序列分析表明,分离株H基因由1 596 bp组成,编码532个氨基酸,含有5个潜在的N-联糖基化位点,12个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.O%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A75/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的同源性,组成一组,而与标准野毒强毒株Hamatsu的亲缘关系较远. 个半胱氨酸残基.与已发表的24株CDV毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性在90.7%～98.6%之间:推导的氨基酸序列同源性在89.9%～97.0%之间.与Onderstepoort、Convac、Hamatsu,A 5/17、TN株相比,根据推导的氨基酸序列比较分析表明,N-联糖基化位点的数目与位置均存在差别.聚类分析结果表明分离株与Snyder Hill毒株的亲缘关系最近,二者与疫苗株Onderstepoort和Convac具有较高的     

安徽IBV地方株AH1-99株S1基因克隆及序列分析

用RT-PCR技术扩增出IBV AH1-99的S1基因cDNA,将其克隆到pMD18-T载体中进行序列测定和分析.结果表明,该分离株S1基因全长共1 611个核苷酸,编码537个氨基酸;与GenBank中登陆的IBV S1基因核苷酸的同源性为76.5%～92.2%,氨基酸同源性为69.3%～89.8%;在IBV S1基因核苷酸进化关系树中,该分离株同H52、M41和Beaudette等亲缘关系较近,在151位有一个EcoR I 酶切位点,有16个潜在的糖基化位点,前18个氨基酸残基为S蛋白的信号肽.     

鹅副粘病毒HZ株HN蛋白基因的克隆及鉴定

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出HN基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中.经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并进行序列测定验证.结果表明,该基因由1 716个核苷酸组成,共编码571个氨基酸.与GenBank下载的11株参考毒株的HN基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、GY97等毒株的核苷酸同源性高达97%以上,而与Lasota、F48E9等经典NDV株的同源性在80%～83%之间.说明HZ株与经典NDV株的亲缘关系较远,而与江苏近年来分离的鹅源副粘病毒株的亲缘关系非常近;本试验克隆到的是完整的鹅副粘病毒HN基因.     

广西巴马小型猪β-干扰素基因的克隆、序列分析和蛋白结构预测

从刀豆素A刺激12 h和15 h的巴马小型猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出β-干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到PMD18-T载体上,进行序列分析和蛋白结构预测。结果表明,克隆的巴马猪IFN-β基因氨基酸序列与GenBank上登录的梅山猪和长白猪的IFN-β基因氨基酸同源性为98.4%和98.9%,与人、牛、马的IFN-β氨基酸同源性分别为65.1%,65.1%,66.1%。人和猪IFN-β基因在5个螺旋结构序列上同源性很高,而且在维持蛋白结构和生物学活性上的氨基酸位点也非常保守。