副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

从云南某规模化养猪场病猪肺脏分离到1株革兰氏阴性小杆菌,经细菌生化鉴定、PCR鉴定和16S rRNA序列比对鉴定为副猪嗜血杆菌。抗生素药物敏感试验结果表明,分离菌株对四环素、红霉素、氯霉素、头孢噻吩高敏;对庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星中敏;对磺胺甲唑耐药。16S rRNA分析结果表明,该分离株与GenBank中的Hps参考株AB078973(基因登录号)同源性为100%,将分离菌株鉴定为副猪嗜血杆菌。16S rRNA遗传进化关系表明,分离株与副猪嗜血杆菌3株血清5型参考株AB078972、AB078973、AB078974的16S rRNA序列位于一个分支上,遗传进化关系最近,它们之间的核苷酸同源性在99.0%~99.4%之间,初步鉴定为血清5型副猪嗜血杆菌,致病性试验结果表明,分离菌株对小白鼠有强致病性,命名为YN-1株。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆鉴定及序列分析

用PCR技术对华南地区分离的17株不同血清型副猪嗜血杆菌菌株ompP2基因进行克隆鉴定,并以CLUSTALS1和PHYLIP-3.68软件将ompP2基因序列进行比对和遗传进化分析.17株副猪嗜血杆菌茵株中均能扩出ompP2基因,克隆测序结果发现ompP2基因大小有所不同,与参考序列ABKM01000007的同源性在92％～99％之间.序列比较结果显示,ompP2基因与GenBank公布的副猪嗜血杆茵全基因组测序中的ompP2基因序列具有较高的同源性,不同菌株ompP2基因序列大小存在差异,为进一步验证ompP2蛋白的功能及相关研究奠定了基础.     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

猪场副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

为查明贵阳市花溪区麦坪镇某猪场仔猪发生呼吸道疾病的病因,对送检的2头病猪采集病料进行细菌分离培养、染色镜检、生化试验、PCR扩增及测序、药敏试验。结果:从病料样本中分离得到1株细菌,根据形态学和生化试验初步鉴定为副猪嗜血杆菌;应用细菌16S rRNA序列分析技术从分子水平对分离细菌进行分型鉴定,运用DNAStar软件与不同血清型副猪嗜血杆菌基因序列进行比对,发现分离菌与不同血清型副猪嗜血杆菌菌株16S rRNA序列同源且相似性为97.4%～100%,其中与血清5型相似性最高;系统进化分析显示,分离菌株与血清5型副猪嗜血杆菌进化关系最近;分离菌株对利福平、头孢氨苄、阿米卡星、环丙沙星、万古霉素敏感。结论:综合分离细菌传统鉴定方法和分子生物学鉴定方法的实验结果,确定分离菌株属于血清5型副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌15个血清型参考菌株acrA基因序列分析

acrA基因在细菌多重耐药中起重要作用.利用PCR扩增副猪嗜血杆菌15个血清型标准菌株acrA基因,应用Clustal W进行氨基酸进化距离分析和同源性分析,绘制进化树.序列测定与分析表明,ac-rA基因在副猪嗜血杆菌15个标准菌株中都存在,其中,血清5型、8型、14型有2个拷贝(acrA1和acrA2).进化距离分析表明不同血清型之间AcrA1氨基酸序列有较大的差异,同源性为89.8％～100％.同一血清型副猪嗜血杆菌acrA1和acrA2氨基酸同源性低于30％,但都位于比较保守的基因座上,这是首次发现副猪嗜血杆菌会存在2个acrA基因.本研究为副猪嗜血杆菌多重耐药机制的研究提供了理论基础,同时对新型抗菌药物的研发也具有重要的参考价值.     

副猪嗜血杆菌病疫苗新制苗菌株FS0307的毒力和OMP P5基因研究

为了进一步研究副猪嗜血杆菌FS0307株的特性,本研究对该菌株的外膜蛋白P5基因进行测序分析,并进行其对豚鼠的致病力研究。结果显示,Hps FS0307株的序列与相同血清型的国际标准株SW124的同源性为98.3%,与多数国内分离株的同源性在98%以上,与美国分离株2170B的同源性为95.6%,而与3株其他血清型国际标准株的同源性在89.5%~95.1%之间;遗传系统进化树显示与4型国内分离株SC085(HM747106)在同一分支上。且能引起豚鼠100%发病,100%死亡。说明Hps FS0307株与国内流行菌株更相似,是1株优良的副猪嗜血杆菌病疫苗的制苗菌株。     

川北地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定

为了给川北地区养猪场提供副猪嗜血杆菌病的科学防控及合理的治疗用药方案,对川北地区西充、三台、绵阳等地规模化猪场保育猪发生的副猪嗜血杆菌病病原进行分离鉴定。采集副猪嗜血杆菌病疑似病死猪的肺、肝、脾、淋巴结、心包液、腹水、关节肿液等样本55例,通过细菌的分离纯化,对分离菌进行了染色镜检、V因子需要试验、致病性试验、PCR鉴定、药敏试验和同源性分析。结果表明,分离出了20株副猪嗜血杆菌,分离株革兰染色为阴性,有荚膜,分离菌株与GenBank公布的12株副猪嗜血杆菌的16S rRNA序列有高度同源性,且分离株对β-内酰胺类、四环素类、磺胺类的耐药率最高。试验结果对于川北地区养猪生产中副猪嗜血杆菌病的有效防治提供依据。     

家养野猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对江西省某家养野猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps）感染的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16SrRNA并进行测序分析,并对分离菌进行细菌形态、生化鉴定和PCR鉴定及序列比对分析。结果显示,获得1株家养野猪源Hps分离株（命名为HPJXYZ01）,该分离株与国内外参考菌株序列之闻的同源性为93．1％～99．2％,与本实验室江西省家猪源分离株的同源性为84％～92．1％。结果表明,江西省家养野猪中存在Hps感染,分离株与国内外家猪源Hps间的16SrRNA序列差异不大,Hps16SrRNA核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。     

2012～2014年江西地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对2012~2014年分离自江西地区41株副猪嗜血杆菌临床分离菌株进行指纹鉴定。结果表明,41株副猪嗜血杆菌产生20种不同的指纹图谱,相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,无法进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分。该方法证实副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱存在丰富的多样性,可适用于副猪嗜血杆菌的快速基因分型及分子流行病学调查。     

河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株调查与耐药性分析

为了解河南省安阳市副猪嗜血杆菌流行菌株的血清型和耐药性情况，2022年从该地区25家养猪场无菌采集临床疑似感染副猪嗜血杆菌的病死猪肝脏、肺脏、关节渗出液等组织病料175份，采用细菌分离纯化培养、形态学观察、“卫星生长”培养、生化反应和PCR鉴定等方法进行副猪嗜血杆菌分离鉴定，应用琼脂免疫扩散法进一步进行血清分型，采用Kirby-Bauer纸片法检测分离菌株对16种抗生素的耐药性。结果显示：从175份组织病料中检测出34株副猪嗜血杆菌，检出率为19.43%；分离菌在含有NAD和犊牛血清的TSA培养基上产生针尖大小、无色透明、光滑湿润的菌落，镜检可见革兰氏阴性、长杆状、细丝状等多形态菌体，在金黄色葡萄球菌周围菌落出现“卫星生长”现象，且无溶血，分离培养结果符合副猪嗜血杆菌特征。经PCR扩增测序，分离菌株与GenBank中公布的副猪嗜血杆菌16S rRNA序列同源性在97%以上；共鉴定出4型14株、5型4株、6型3株、13型8株和未定型5株，分别占41.18%、11.76%、8.82%、23.53%和14.71%;34株副猪嗜血杆菌对对阿莫西林、青霉素G、链霉素、土霉素4种抗生素耐药性最高，...     

河南省平顶山地区副猪嗜血杆菌分离鉴定和外膜蛋白P5基因序列分析

为了解河南省平顶山地区副猪嗜血杆菌流行的血清型、菌株耐药性及其外膜蛋白ompP5基因的变异情况,采集疑似副猪嗜血杆菌病猪病料进行细菌分离鉴定、血清型鉴定、药敏试验和动物试验;测定5株不同血清型菌株的ompP5基因序列,分析其同源性。结果:分离鉴定了42株副猪嗜血杆菌,主要血清型为1(38.1%)、4(19.0%)、5(26.2%)、12(11.9%)和未定型(4.8%)。药敏试验显示菌株对磺胺甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶和头孢喹肟耐药性较强,耐药率分别为85.7%、83.3%和64.3%,对氟苯尼考和青霉素高度敏感。基因序列分析显示菌株ompP5基因序列与其血清型、致病性无明显相关性。该研究为平顶山地区副猪嗜血杆菌病的防控提供了一定的理论依据。     

镇江地区副猪嗜血杆菌分离鉴定血清型及耐药性检测

为了解镇江地区副猪嗜血杆菌血清型流行情况与耐药性情况,本试验采集患病仔猪的肺脏、肝脏、关节渗出液等病料组织85份,采用细菌分离、形态学观察、培养特征鉴定、PCR鉴定等方法对副猪嗜血杆菌进行鉴定,采用PCR法和K-B药敏纸片法分别检测副猪嗜血杆菌血清型及耐药性。结果显示,从85份病料组织中分离得到48株副猪嗜血杆菌;48株副猪嗜血杆菌具有7种血清型,其中,血清5型和12型为流行的主要优势血清型,分别占分离菌株的25.0%和31.3%; 48株副猪嗜血杆菌对磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、庆大霉素等9种药物耐药率在50.0%～100.0%之间,对其他药物耐药率在12.5%～25.0%之间。说明该地区分离的副猪嗜血杆菌血清型流行情况复杂,且耐药性严重。本试验为该地区的副猪嗜血杆菌防控提供研究基础。     

副猪嗜血杆菌thyA基因的序列分析

为探究副猪嗜血杆菌thyA基因的遗传特性,针对于分离的副猪嗜血杆菌辽宁分离株的thyA基因进行测序,并运用软件对基因序列及氨基酸序列的同源性等进行分析研究。结果显示,thyA基因在副猪嗜血杆菌辽宁株亲缘性较高,其中基因序列与已公布的参考菌株同源性为95.7%~100%,氨基酸序列同源性为97.2%~100%,预测thyA基因编码蛋白的三级结构,发现thyA毒力基因在副猪嗜血杆菌中保守存在,为揭示thyA基因在副猪嗜血杆菌中功能奠定了一定基础。     

A型副鸡嗜血杆菌(山东株)的分离与鉴定

2011年11月,山东某肉鸡场发生以肉鸡眼睑及眶下窦周围明显肿胀为主要特征的传染性疾病。从采集的发病鸡眶下窦中分离到1株细菌,根据发病鸡群的临床症状、细菌的分离培养、形态观察、过氧化氢酶试验、革兰氏染色、动物回归试验、免疫攻毒试验和PCR等方法初步鉴定为副鸡嗜血杆菌(Hpg)。此外通过分离菌株的水平传播试验结果表明,造成该鸡场Hpg的水平传播和鸡传染性鼻炎的反复发作与饲养密度有很大的关系。最后将分离菌株送匈牙利诗华研发中心进行分型鉴定,确定为A型副鸡嗜血杆菌。根据分离地点将分离菌株命名为A型副鸡嗜血杆菌(山东株)。另外通过与GenBank已发表的Hpg基因序列进行同源性比对分析,结果显示,该基因序列与参考株的基因核苷酸序列同源性达99.0%。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其OmpP5基因序列分析

为研究辽宁省副猪嗜血杆菌(Hps)OmpP5基因的遗传变异规律,从辽宁省阜新市某猪场疑似患有副猪嗜血杆菌病的患猪肺部采取组织病料进行细菌分离,通过革兰染色、生化鉴定、卫星现象及Hps 16S rRNA PCR检测,鉴定为副猪嗜血杆菌。根据已发表的Hps OmpP5基因设计1对特异性引物,对分离株OmpP5基因进行扩增、克隆及测序,得到长度为1 116bp的OmpP5基因序列。将该序列与已发表Hps参考株的OmpP5基因进行同源性比对及系统发育树分析,发现核苷酸同源性为89.8%~99.5%,分离株与参考菌株№4在同一分支,表明OmpP5基因具有一定的保守性,分离株和№4亲缘关系较近。研究结果为阐明辽宁省Hps毒力基因及致病机理提供了参考依据。     

河南副猪嗜血杆菌病流行病学调查

于2011年3月至2012年2月调查了河南周口、安阳、新乡、濮阳、驻马店、南阳等6个市60个猪场副猪嗜血杆菌病流行情况.采集病猪组织样品共96份进行副猪嗜血杆菌分离;对疑似菌株进行形态学观察、生化特性鉴定;最终分离鉴定到30株副猪嗜血杆菌,分离率为31.25％;对分离菌株进行血清型鉴定、致病性和药敏试验,结果表明,30株分离株中血清4型有6株,5型5株,9、11、13、14、15型各1株,其余13株未能鉴定出血清型.血清型5、13、14菌株和5个未能定型的菌株能引起小鼠全部死亡,其他菌株对小鼠致病性不强.药敏试验结果表明,63％以上的菌株除对庆大霉素、头孢喹诺高度敏感外,对其他药物敏感性不高.本调查结果将对河南副猪嗜血杆菌病的防治提供指导.     

副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱多样性研究

建立了副猪嗜血杆菌ERIC-PCR分型技术,并应用于临床分离菌株的流行病学调查。试验结果表明,47株副猪嗜血杆菌产生28种不同的指纹图谱,分离自同一猪场和相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,不能进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分,证实副猪嗜血杆菌ERIC指纹图谱存在丰富的多样性,ERIC-PCR方法是副猪嗜血杆菌流行病学规律分析的有效方法。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及药敏试验

黑龙江省近几年频繁发生以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎以及急性死亡为特征的传染病,为猪场造成严重经济损失,为了确诊是否有副猪嗜血杆菌感染,采集病死猪肝脏、脾脏和肺脏等病料,进行副猪嗜血杆菌的分离;对其理化特性进行鉴定,应用PCR方法对其16S rRNA基因扩增后进行克隆测序,将测序结果在GenBank上进行BLAST分析,把相近的基因序列应用DNAStar软件进行同源性和进化关系分析;用分离菌株进行药物敏感性试验,筛选敏感药物。结果分离出一种具有多形性的NAD依赖性菌株,经鉴定为副猪嗜血杆菌;16S rRNA基因进化分析结果表明,分离菌株与以往报道的副猪嗜血杆菌中国、日本和美国分离株属于同一亚群,而西班牙分离株属于单独的亚群;分离菌株对壮观霉素和头孢拉定高度敏感。     

副猪嗜血杆菌分离株hhdA和hhdB基因的克隆及同源性分析

用预先设计好的hhdA和hhdB基因的PCR扩增引物,扩增不同血清型的副猪嗜血杆菌分离株中的hhdA和hhdB基因,将扩增产物与克隆载体pMD ^TM18-T连接,转化入感受态细胞DH5α,通过PCR、双酶切及序列测定,测序结果表明：扩增的16株HPS菌中有11株能扩增出hhdA基因,其中10株有测序结果,该10株菌的hhdA基因全基因序列有7种长度,分别为1754、1755、1758、1759、1760、1761和1762bp。另外,16株HPS菌中有9株能扩增出hhdB基因,该9株菌的hhdB基因全基因序列有7种长度,分别为1628、1637、1639、1640、1641、1646和1647bp。对于相同血清型的不同菌株来说,它们的2段目的基因序列长度两两不一致。强毒株中,71％的菌株均能扩增出hhdA和hhdB基因;中毒型菌株也基本可以扩增出hhdA和hhdB基因;而无毒型菌株均没有扩增出目的基因。同源性比对可知：所分离菌株的hhdA之间和hhdB基因之间,以及它们分别与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdA和hhdB基因之间序列同源性都在98％以上,说明所分离的菌株中均含有hhdA和hhdB基因序列。同源系统进化树分析可知,hhdA和hhdB基因在分离菌菌株间具有良好的保守性,可作为研制HPS新型疫苗的候选基因。     

副猪嗜血杆菌Shandong2007株的分离与鉴定

对1例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的仔猪病料进行实验室诊断,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性等鉴定,根据副猪嗜血杆菌的16 S rRNA基因设计特异性引物进行PCR扩增,将822 bp片段连入T-载体后测序,再通过GenBank进行比对分析.生化试验结果为接触酶阳性,氧化酶和H2S阴性;生长需要NAD,发酵果糖、半乳糖和蔗糖等,不分解D-甘露醇和D-山梨醇.药敏试验显示,对氨苄青霉素、丁胺卡那霉素等药物敏感.PCR鉴定结果与国外副猪嗜血杆菌菌株16 S rRNA序列的同源性为99%以上,初步鉴定该分离菌株为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps).