家蚕病原性微孢子虫多样性调查分析

[目的]从分布、感染性和分类特征三方面调查家蚕病原性微孢子虫多样性,为蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病提供参考依据.[方法]跟踪蚕种生产微粒子病检疫数据及抽样检验家蚕受微孢子虫感染的情况,调查家蚕病原性微孢子虫的分布;通过测定微孢子虫对家蚕的半数感染浓度(IC50)和胚种传染率及检验带毒蚕种的微粒子病胚种传染率,调查家蚕病原性微孢子虫的感染性;基于微孢子虫SSU rRNA序列构建家蚕病原性微孢子虫系统发育进化树及进行相似性和遗传距离分析,调查家蚕病原性微孢子虫的分类特征.[结果]不同时间和不同蚕区生产饲养的广西家蚕均存在一定量的微孢子虫感染,蚕种微粒子病发生率(毒率)呈波动起伏态势.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9、GXM10、GXM11、GXM12和GXM13等11株异型微孢子虫对家蚕均具有较强食下传染力,大部分异型微孢子虫对家蚕的IC50与N.b同一级别;各种微孢子虫对家蚕的胚种传染力存在明显差异,N.b的胚种传染率达51.67%,其他异型微孢子虫均比N.b低,部分异型微孢子虫(GXM6和GXM13)对家蚕无胚种传染力.GXM3、GXM4、GXM5、GXM6、GXM7、GXM8、GXM9和GXM11等8株异型微孢子虫均位于Nosema属的类群分支上,除GXM7与GXM9、GXM3与GXM5间存在较低分化度和较高相似度外,其他微孢子虫间的分化度和相似度均存在明显差异.[结论]广西蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛,种类繁多,且各种微孢子虫的感染力存在明显差异,即广西家蚕病原性微孢子虫存在丰富的种类多样性.     

重庆地区蜜蜂微孢子虫的鉴定及分子遗传多样性分析

采用PCR扩增、克隆与测序的方法,对重庆东南地区引起意大利蜜蜂(意蜂)蜂群出现明显下降趋势的病原微孢子虫的遗传标记基因SSU r DNA(小亚基核糖体脱氧核糖核酸,small subunit ribosomal DNA)和ITS(内转录间隔区,internal transcribed spacer)以及3个单拷贝座位分子标记肌动蛋白基因(Actin),热激蛋白基因(Hsp70)和RNA聚合酶基因(RPB1)进行分子水平扩增及测定,并与国内外不同地理分布的蜜蜂微孢子虫种群进行了分子遗传多样性比较及单倍型分析。结果显示,该蜜蜂微孢子虫分离种群为东方蜜蜂微孢子虫,命名为CQYX。序列分析表明东方蜜蜂微孢子虫重庆分离群与其它地理种群之间的遗传多样性水平上无差异性。高频单倍型为重庆CQYX地理群与其他不同地理种群所共有,并分化成不同的低频种群特异性单倍型,表明重庆CQYX种群和其他不同地理来源的东方蜜蜂微孢子虫种群具有共同的遗传起源,并经历了近期的快速扩增。本研究有助于进一步在分子水平上探讨意蜂中东方蜜蜂微孢子虫的地理起源。     

广西昆虫微孢子虫资源调查及其特性分析

[目的]全面掌握广西昆虫微孢子虫资源及其分布情况,并进行感染性和分类研究,为经济昆虫微孢子虫病的防控提供参考依据.[方法]通过人工捕捉或诱虫灯引诱方式在广西蚕区的桑园、菜地及周围收集野外昆虫,显微镜检验各种野外昆虫微孢子虫的自然感染率;通过生物试验鉴定部分野外昆虫微孢子虫对家蚕的食下感染性,并分别检测桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染性;基于SSU rRNA序列构建昆虫微孢子虫系统发育进化树,明确昆虫微孢子虫的分类特征.[结果]广西昆虫微孢子虫资源分布广泛,大部分昆虫已感染微孢子虫,其中菜粉蝶、稻纵卷叶螟、桑螟、桑尺蠖、斜纹夜蛾和红腹灯蛾的微孢子虫自然感染率分别为54.95%、4.38%、0.08%、0.28%、0.64%和1.14%,其他鳞翅目昆虫的总体微孢子虫感染率为0.75%.部分昆虫微孢子虫可食下感染家蚕,交叉感染率达40.00%;部分昆虫微孢子虫还具有很强的胚种传染力,其中桑尺蠖微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫对原始寄主的胚种传染率分别为77.48%和66.15%.从桑尺蠖分离获得的3株微孢子虫虽然为不同的微孢子虫,但均属于Nosema属,与家蚕微孢子虫同属异种.[结论]在广西各地区存在丰富的昆虫微孢子虫资源,种类多样,且大部分昆虫微孢子虫属于Nosema属,与家蚕微孢子虫亲缘关系密切;部分野外昆虫微孢子虫还对家蚕形成交叉传染危害的风险,因此杜绝昆虫微孢子虫污染桑叶交叉感染家蚕是控制家蚕微粒子病发生的重要措施.     

我国四省区熊蜂中微孢子虫的自然感染率

采用SSUrRNA基因序列检测鉴定方法,初步调查了甘肃、青海、四川、内蒙古26种1008只熊蜂的微孢子虫感染情况及种类.结果表明:其中有16种210只被微孢子虫感染,感染率为20.8%,白背熊蜂和西伯熊蜂的微孢子虫感染率最高,红束熊蜂的感染率最低.内蒙古地区熊蜂微孢子虫的感染率最高,四川次之,甘肃与青海地区熊蜂的微孢子虫感染率最低.感染熊蜂的微孢子虫有熊蜂微孢子虫、东方蜜蜂微孢子虫和发现于鳞翅目卷叶蛾科寄主上的Nosema thomsoni.这说明微孢子虫对我国熊蜂的感染很广泛.     

10株微孢子虫Hsp70基因克隆及系统发育分析

对10株不同来源的微孢子虫Hsp70基因部分序列进行扩增,并进行了系统发育分析,结果表明:所设计的引物可以有效地扩增出10株家蚕等昆虫微孢子虫Hsp70基因中1136 bp大小的片段。遗传距离矩阵和系统发育分析表明,家蚕微孢子虫与野外昆虫微孢子虫的亲缘关系密切,再次从分子水平上证明了家蚕病原微孢子虫来自环境中的野外昆虫微孢子虫的可能性;不同微孢子虫在不同寄主中的寄生生活是一个相互选择和适应的过程;微孢子虫Hsp70基因具有遗传多样性;家蚕微孢子虫是一个种复合体。     

不同品种及性别家蚕感染菜粉蝶微孢子虫差异性分析

为了解不同品种及不同性别家蚕感染菜粉蝶微孢子虫的差异性,利用菜粉蝶微孢子虫对9个不同的家蚕品种(8个原种、1个杂交种)进行感染性添食试验,添食菜粉蝶微孢子的浓度和数量均相同。结果表明,家蚕各品种之间感染菜粉蝶微孢子虫的情况存在明显的差异,秋华最容易被微孢子虫感染,皓月感染力最低。同时,对不同家蚕品种雌雄蛾感染率进行调查,发现家蚕雌雄蛾之间感染菜粉蝶微孢子虫的差异并不显著。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)对三峡库区菜青虫(Pieris rapae)的感染性研究

本试验用不同浓度的家蚕微孢子虫感染三峡库区菜青虫,结果表明:家蚕微孢子虫对菜青虫感染性较强,致死率高,其致死中量(ID50)为:1.5×104个/m l。当微孢子虫浓度为1.0×107个/m l时,菜青虫死亡率高达87.8%,校正死亡率也高达86.4%,体现了家蚕微孢子虫对菜青虫的显著致病能力,由此探索了家蚕微孢子虫作为生物农药的可行性。     

模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究（11）

家蚕微粒子病病原为桑蚕微孢子虫(Nosema bombycis Nageli, N.b)。本文根据文献报道,选用了一对根据N.b孢子及其相近种属微孢子虫的SSU-rRNA保守区段设计的有效引物VIF/530R,从模拟感染不同浓度N.b孢子(3×101-7/ml)的蚕蛾、蚕卵的角度,较系统地研究了PCR诊断技术的可检测灵敏度和对模拟感染家蚕微粒子病的诊断效果,为PCR分子诊断家蚕微粒子病的实用化研究提供参考。在本实验的DNA制备方法和PCR反应条件下,分别对由不同浓度N.b纯孢子抽提的DNA模板和不同浓度N.b纯孢子(3×101～7ml-1)分别与蚕卵、蚕蛾混合抽提的DNA模板进行PCR扩增检测。结果表明:(1)对N.b纯孢子DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×104N.bml-1(弱检测信号可到3102～3N.bml-1),对模拟染毒N.b孢子的蚕蛾DNA模板,PCR可检测灵敏度为3×105N.bml-1,两者分别已超过或达到目前生产上用显微镜的检毒水平;(2)对模拟染毒N.b孢子的蚕卵DNA模板,VIF/530R引物不能有效地检出蚕卵中染毒的N.b孢子DNA信号,推测在蚕卵DNA抽提物里可能含有抑制PCR扩增的未明因素,而蚕蛾DNA抽提物里则无此抑制因素。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染菜粉蝶(Pieris rapae)幼虫初探

采用不同浓度的家蚕微孢子虫感染三峡库区菜粉蝶幼虫—菜青虫,结果表明:家蚕微孢子虫对菜青虫感染性强,致死率较高,其半致死浓度(LC50)为:1.46×104/mL。当微孢子虫浓度为1.0×107/mL时,菜青虫死亡率高达88.9%,校正死亡率也高达87.2%,显著体现了家蚕微孢子虫对菜青虫幼虫的致病能力,由此探索了家蚕微孢子虫做为生物农药的可行性。     

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。     

微孢子虫起源和进化研究进展

微孢子虫是一种典型的机会性致病病原,具有特殊的真核生物构造。综述了微孢子虫起源和进化的研究进展,以及在分析其系统发育过程中的一些潜在的问题及解决的方法,并提出β-微管蛋白及多基因研究在分析微孢子虫进化中具有重要性。     

应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物，对沙门氏菌属A－F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行聚合酶链反应（PCR）扩增，结果沙门氏菌均出现495bp特异性DNA扩增条带，所有对照均未出现特异条带，提示这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR敏感性试验显示，该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较，选择操作简便、快速、成本低廉的热裂解法。采用该方法。采用该方法，对生鲜奶样进行检测，经与国家标准卫生检验方法相比较，两者符合率达100％。     

天牛干标本DNA的提取及RAPD-PCR扩增反应

对标本馆保存多年的天牛标本进行基因组DNA的提取,并成功用于PAPD-PCR的扩增。结果显示基因组DNA的提取与标本的保存时间无直接的联系,而与标本保存的质量关系密切。用同一引物扩增,不同种天牛的扩增片段呈现多态性。     

用显微光度计对不同细胞DNA含量的测定

显微光度计可以直接测量单细胞内核酸、蛋白质和酶的含量,每条染色体的 DNA 量和带数以及免疫反应中结合抗体的定量等。我们用 Univar 显微光度计比较了吸收扫描法和荧光法的效果。实验测定了小麦和大麦根尖细胞、鸡血细胞,镰刀菌孢子和酵母菌不同生长阶段的细胞。结果表明吸收扫描法测定小麦六倍体、四倍体和二倍体 DNA 含量,其比值为3.2:2.1:1。荧光测定酵母菌子囊孢子 DNA 含量(任意值)为462.61,营养细胞为914.38,两个子囊孢子核结合后为925.08。对大细胞(植物)两种方法效果都好。对小细胞(微生物)荧光法较吸收扫描法更为稳定。     

人类3个多肽基因的人工合成和对人工基因合成意义的探讨

本文报道了胰岛素A,B链基因,人表皮生长因子基因和人α心钠素基因的人工合成。人工合成是在DNA合成仪上完成的,先合成上述基因的平均为60个核苷酸的各寡核苷酸片段,经过对各片段的纯化、磷酸化和连接,得到上述多肽基因。并进行了电泳检测。人工基因合成的重要意义在于可以正确地、高效地合成基因工程所需的基因,是获得在原核生物中表达的多肽基因的主要途径,并可将重组DNA和表达所需的碱基顺序同时组合在合成的基因中。人工基因合成有广泛的应用前途和价值。     

用RFLP技术检测水稻染色体片段的来源

利用已定位的28个RFLP标记为探针,测定了IR8及其亲本在9种限制性内切酶酶切条件下的RFLP表现,以此来判断IR8品种中这些标记所在的染色体片段来源。结果,有18个标记揭示了品种间的RFLP存在。根据RFLP图谱,IR8品种中9个标记的图谱相同于Peta,5个标记的图谱相同于低脚乌尖（DGWG）,这表明这些标记所在的染色体片段分别来自Peta和DGWG。另外3个标记显示了IR8特有的RFLP图谱,表明IR8中这些标记所在的染色体片段的DNA顺序已经发生了重组。在IR8不同个体的测定中,发现了一个不与RG365标记DNA杂交的个体,该个体可能是缺少RG365标记同源顺序的突变体。RG237标记的EcoRV酶切条件下,也揭示了个体间的RFLP存在。     

星形细胞瘤及星形细胞反应性增生中胶质原纤维酸性蛋白和DNA的定量研究

用全自动图像分析仪，对４０例－Ⅰ－Ⅳ级星形细胞瘤及１０例星形细胞反应增生了胶质原纤维酸性蛋白免疫组化及ＤＮＡ组织化学的定量研究，结果显示：星形细胞反应性增生时，ＧＦＡＰ含量高于星形细胞瘤，随着星形细胞瘤分级的递增，ＧＦＡＰ含量农渐降低，ＤＮＡ含量恰好遵循相反的规律；ＧＦＡＰ和ＤＮＡ含量之间有良好的线性相关关系。     

咖啡因Na_2─EDTA对辐照大豆和油菜幼苗DNA合成的影响

本文研究了咖啡固和Ｎａ２一ＥＤＴＡ后处理对不同辐照敏感性作物幼苗ＤＮＡ、ＲＮＡ含量和修复能力的影响。结果表明，随着辐照剂量的增大，大豆（对辐射敏感）和油菜（抗辐射）７天龄幼苗下胚轴内ＤＮＡ，ＲＮＡ含量随之增大，且大豆的ＤＮＡ含量比油菜高２倍多。咖啡固和Ｎａ２一ＥＤＴＡ后处理，均高于对照。放射性３Ｈ─ＴｄＲ标记６渗入法证实，种子辐照后，７日龄幼苗体内仍存在着非按期的ＤＮＡ合成，且油菜的非按期ＤＮＡ合成能力强于大豆。咖啡固、Ｎａ２─ＥＤＴＡ和二者复合作用的后处理，抑制了ＤＮＡ的非按期修复合成，加重了辐射损伤，其抑制程度，咖啡因＋Ｎ８２－ＥＤＴＡ＞咖啡固＞Ｎ８２─ＥＤＴＡ。     

马铃薯晚疫病菌基因文库的构建

用酶一氯化苄法制备高分子量晚疫病菌总ＤＮＡ,通过Ｓａｕ３Ａ部分酶切并纯化后得到１５－２５ｋｂ的酶切片段,并以具有广寄主范围的柯斯质粒ＰＬＡ２９１７为载体,用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连成为重组ＤＮＡ,包装到入噬菌体颗粒中,转染受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＳ１７－１。利用四环素和卡那霉素抗性来筛选鉴定重组子,得到１０６５６个重组子,这些重组子群即为晚疫病菌的基因组文库。