H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

 【目的】建立H1N1亚型猪流感病毒反向遗传学操作系统及拯救出能够在动物传代细胞中高水平复制的H1N1亚型猪流感疫苗株。【方法】利用反向遗传操作技术,对猪流感病毒广东分离株进行拯救。【结果】首次成功拯救出全部片段均来自于亲本株的猪流感病毒rH1N1,并且成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株re-LM株,研究结果表明二者均具有良好的遗传稳定性。rH1N1经MDCK细胞连续传代培养后,血凝价最高仅为1﹕64;而re-LM的血凝价最高可以稳定在1﹕1 024,表明该毒株具有细胞繁殖高产的特性。用该重组病毒制备油乳剂灭活苗免疫2月龄仔猪,首免2周即可检测出HI抗体,平均效价在1﹕32以上,三免后2周HI抗体平均效价达到1﹕512,说明其有良好的免疫原性。【结论】H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;重组细胞高产型猪流感病毒株的拯救为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

2009～2013年广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒血清学调查

[目的]了解广西H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)的存在形势及其流行规律,为下一步有效监测和防控猪流感(SI)提供理论依据和原始溯源.[方法]对2009～2013年于广西11个地级市的屠宰场、规模化养猪场和个体养殖户采集的1170份猪血清进行血凝抑制(HI)试验检测,统计欧洲禽源H1N1 (EA-H1N1)亚型和新型人源重组H3N2(Hu-H3N2)亚型4株毒株(LB 144和BB2、NNXD和JGB4)的抗体阳性率,并分析H1N1和H3N2亚型毒株的存在形势及其流行规律.[结果]2009～2013年,EA-H1N1亚型LB144毒株的平均抗体阳性率高达20.68％,且保持稳定,是广西地区主要的流行毒株;Hu-H3N2亚型JGB4毒株从2010年开始流行,且呈逐渐蔓延的趋势,平均抗体阳性率为19.96％.广西北海、南宁、玉林、贺州、桂林、贵港和柳州市受到EA-H1N1和Hu-H3N2亚型毒株多重感染,且感染程度较严重;百色、河池和防城港市的感染程度相对较低.育肥猪最易感染SIV,尤其是BB2和JGB4毒株,其抗体阳性率分别达66.00％和40.00％.EA-H1N1亚型毒株间的交叉感染阳性率(21.52％)略低于Hu-H3N2亚型毒株间的交叉感染阳性率(27.45％),而两株不同亚型毒株交叉感染时以BB2与JGB4毒株的交叉感染阳性率最高(16.23％),3株交叉感染时以BB2、NNXD和JGB4毒株间的交叉感染阳性率最高(11.60％),4株同时交叉感染阳性率也有6.96％.[结论]广西猪群已普遍存在EA-H1N1和Hu-H3N2亚型毒株混合感染的现象,尤其是地处两省边界上的地级市感染更严重,并以育肥猪和保育猪较易感.因此在SI防控工作中,除做好哺乳仔猪和种猪的日常管理外,还应减少保育猪的外来应激,适当调整育肥猪的饲养密度,以减少新型SIV重组毒株的产生.     

用反向遗传8质粒系统构建流感H1N1重组病毒

为了建立用于流感病毒拯救的反向遗传操作系统,用RT-PCR方法扩增得到A型流感病毒流行株A/shanghai/7/99的HA和NA基因,将其克隆到pGEM-T载体上并测序,挑选阳性克隆分别用BsmBⅠ、BsaⅠ酶切,连接到以BsmBⅠ酶切的双向转录/表达载体pAD3000上,获得重组质粒pAD-HA和pAD-NA,分别与含A/PR/8/34流感病毒7个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,拯救了重组病毒R-HA-PR8和R-NA-PR8,说明构建的重组质粒pAD-HA和pAD-NA是正确的,将pAD-HA和pAD-NA与含A/PR/8/34流感病毒6个基因的阳性质粒共转染COS-1细胞,培养48 h后吸取上清液及COS-1细胞,接种10日龄SPF鸡胚,孵育96 h后,收获鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验。结果显示,鸡胚尿囊液中重组病毒H1N1的血凝效价和血凝抑制效价均为29,鸡胚半数感染剂量为10-8.5~10-9。病毒的成功拯救为进一步深入研究流感病毒的基因功能以及流感新型疫苗的研发奠定了基础。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

 A/goose/Guangdong/1/96（GSGD/1/96）是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒，它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株，而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统，并通过细胞转染成功拯救了该病毒（R-GSGD/1/96）。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和 Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性，即对鸡都是高致病性毒株，R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10；救获病毒与野生病毒一样，尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2 d内能从肺脏检测到低滴度的病毒，但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。     

3株H1N1亚型猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原特异性分析

【目的】分析3株属于欧亚类禽(SWSS1)、经典(SWL6)与Pdm09H1N1(Pdm091057)分支的猪流感病毒的HA基因遗传信息及抗原的特异性,为HA基因抗原表位的功能研究及流感防控奠定基础。【方法】以SWSS1株、SWL6株和Pdm091057株流感病毒为材料,比较分析3株H1N1亚型HA基因片段的遗传信息,制备全病毒灭活疫苗,各免疫3只雌性新西兰大白兔,采用血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)反应试验检测抗体滴度。【结果】3株病毒的HA基因片段的氨基酸序列相似性为69.4%~89.1%,各分支的HA基因的抗原表位存在差异;3株病毒经过2次免疫后平均HI抗体滴度均能达1 280以上,且SWSS1的平均HI抗体滴度高达2 560。同时SWSS1与SWL6、Pdm091057这2株病毒均无血清学交叉反应,而SWL6与Pdm091057有较低的血清学交叉反应。【结论】3株猪流感病毒的HA基因片段抗原表位存在着差异,可能是3毒株之间血清学交叉反应较低的原因。3株病毒免疫原性均较好,可作为候选疫苗株。     

H1亚型猪流感病毒的分离鉴定

从山东、浙江、湖南、广西等地区各猪场采集30份疑似猪流感病猪的病料,通过鸡胚培养、血凝及血凝抑制试验、电镜观察、RT-PCR和测序分析进行了分离鉴定。结果从山东和湖南两地分离到4株有血凝活性的病毒,其中山东的2株病毒与新城疫病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性,通过电镜观察湖南的2株病毒具有猪流感病毒的特征,且与抗H1亚型猪流感病毒阳性血清的血凝抑制试验为阳性;根据H1亚型猪流感病毒HA基因设计引物,利用RT-PCR扩增出543bp片段,经序列分析证实该病毒为H1亚型猪流感病毒。     

不同疫苗接种对鸡免疫学功能的影响试验

为验证不同疫苗免疫对鸡免疫学功能的影响,采用两批市售的鸡新城疫-传染性支气管炎-禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗注射14日龄鸡,同时按0.3 mL·只-1注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）,并同时设单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组和健康对照组,每组鸡各10只,分别于疫苗注射后14、21和28 d,对各组鸡采血,分离血清,进行H5亚型禽流感HI抗体效价测定。结果表明：注射后14、21和28 d,第1组（新支流三联180010900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:415.6,第2组（新支流三联180020900批）组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价分别为1:68.6、1:207.9和1:445.7;第三组单独注射重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗（细胞源,Re-6株+Re-8株）组鸡血清中H5亚型禽流感抗体效价分别为1:64.0、1:194.0和1:388.0,健康对照组鸡血清中H5亚型禽流感HI抗体效价均不高于1:24.3。说明接种2种疫苗试验鸡血清H5亚型...     

广西猪流感病毒H1N2亚型的血清学调查

【目的】了解广西猪群中猪流感（SI）的流行情况,为科学防控广西SI提供参考依据。【方法】以猪流感病毒（SIV）H1N2亚型毒株为抗原,采用微量血凝抑制试验（HI）方法,对2009年7月~2011年3月在广西12个市采集的997份猪血清进行SIV的血清学调查。【结果】2009年的H1N2亚型抗体阳性率为33.4%,比2010年和2011年1～3月的高;广西各市的H1N2亚型抗体阳性率为0~83.1%,其中河池和百色两市的H1N2亚型抗体阳性率较高,分别为83.1%和51.1%,崇左市为零,其他市的H1N2亚型抗体阳性为4.0%~32.1%。【结论】广西地区猪群在2009～2011年均受到猪源H1N2亚型不同程度的感染。     

猪对禽用禽流感H5N1基因重组灭活疫苗免疫应答

为评估猪对禽流感疫苗的敏感性、安全性和免疫效果,将63日龄育肥肉猪分为4组,按不同剂量进行禽流感H5N1亚型疫苗的免疫试验,其中第1、3组于首免后第21天按同样剂量进行二免。结果表明:试验猪首免后第10天能检出特异性禽流感抗体,随后抗体转阳率和抗体效价持续上升。二免试验组免疫反应优于一免试验组,而以第1组免疫效果最好。同时,采用荧光RT-PCR技术对试验猪的鼻拭样品进行H5亚型禽流感病毒的检测,结果均为阴性,表明目前使用的禽流感H5N1疫苗不会造成猪体带毒,使用安全。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

Reconstitution of G1 cyclin ubiquitination with complexes containing SCFGrr1 and Rbx1

Control of cyclin levels is critical for proper cell cycle regulation. In yeast, the stability of the G1 cyclin Cln1 is controlled by phosphorylation-dependent ubiquitination. Here it is shown that this reaction can be reconstituted in vitro with an SCF E3 ubiquitin ligase complex. Phosphorylated Cln1 was ubiquitinated by SCF (Skp1-Cdc53-F-box protein) complexes containing the F-box protein Grr1, Rbx1, and the E2 Cdc34. Rbx1 promotes association of Cdc34 with Cdc53 and stimulates Cdc34 auto-ubiquitination in the context of Cdc53 or SCF complexes. Rbx1, which is also a component of the von Hippel-Lindau tumor suppressor complex, may define a previously unrecognized class of E3-associated proteins.     

Cdh1和Num1过表达菌株的构建

[目的]研究Cdh1和Num1之间是否存在相互作用,构建用于Cdh1和Num1免疫共沉淀试验的过表达菌株。[方法]首先在酵母菌株YWL630中用GAL1和3HA对CDH1进行标记,构建GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株,再利用酵母四分体解离的方法使菌株YWL63和YWL490分别与该菌株杂交并进行四分体解离,从而得到所需菌株。[结果]成功构建不同基因型和配型的重组酵母菌株,其中YT52成功过表达了约340 kD的Num1,YT53成功过表达了340 kD的Num1和75 kD的Cdh1,YT57成功过表达了75 kD的Cdh1。[结论]经过同源重组的方法成功标记CDH1并诱导蛋白过表达,通过酵母四分体解离的方法构建用于Cdh1和Num1互作试验的过表达菌株,为揭示APC/C是否介导Num1的降解及机制奠定基础。     

不同因素对接种甲流疫苗献血者高效价甲流抗体产生的影响及意义

目的探讨不同因素对接种甲流疫苗献血者高效价甲流抗体产生的影响。方法用ELISA法检测东莞市986例接种甲流疫苗的无偿献血者的抗H1N1IgG,同时应用效价为320的高效价对照血清光密度作为筛查高效价甲流抗体血清的参照值。结果高效价率和高效价S／CO值在不同性别和年龄组间差异无统计学意3L（P〉0．05）,但接种时间71—90姐的高效价率和高效价S／CO值明显高于接种时间31～50d和51～70d组（P〈0．05）。结论高效价甲流抗体的产生与接种时间有关,而与性别、年龄无关。     

小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异

【目的】研究小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异,为1BL.1RS在小麦育种中的进一步应用提供依据。【方法】利用GISH和FISH技术从小麦品种绵阳11(MY11)和白粒黑麦远缘杂交的后代中筛选1R(1B)代换系G1和1BL.1RS易位系G2。选用小麦染色体1B上的40对引物对亲本MY11、白粒黑麦、G1、G2以及普通小麦中国春(CS)进行SSR分析。【结果】6对引物在MY11、CS及G2中扩增出1BL的条带,在G1和白粒黑麦中未扩增出条带,其中3对引物(Xgwm259、Xbarc188,Xgwm268)在亲本MY11及后代1BL.1RS易位系(G2)中扩增出差异性的1BL条带,说明在小麦-黑麦远缘杂交产生的易位系后代中,1BL染色体臂发生变异。有13对引物在MY11、白粒黑麦和G1、G2中扩增出差异性条带,说明在小麦-黑麦远缘杂交后代中小麦微卫星发生了一定的变化;引物Xbarc8能扩增出白粒黑麦染色体1RS的特异条带,且该条带稳定出现,可以作为白粒黑麦1RS染色体识别和鉴定的分子标记。【结论】小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂发生变异,Xbarc8是鉴定白粒黑麦1RS染色体臂的新的分子标记。     

4-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-乙醇的酯类衍生物的合成

以β-蒎烯和多聚甲醛合成诺卜醇反应中的主要副产物4-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-乙醇为原料,合成了4-(1-甲基乙烯基)-1-环己烯-1-乙醇乙酸酯和丙酸酯,并用IR,MS,1H NMR及13C NMR分析对它们的结构进行了表征。这2个化合物均未见文献报道,并且具有良好的香气性质。采用共沸脱酸的方法,2个产物GC纯度分别为98.8%和98.6%,产率均在96%以上,因此共沸脱酸比较适合这2个产物的合成。     

西藏雅鲁藏布江中部流域发现的古青稞（Hordeun vulgare L.var …

本文报道了在西藏雅鲁藏布江中部流域昌果沟遗址发现的距今3500年新石器时代晚期的古青稞炭化粒,并对此进行了相关的讨论。     

生防放线菌SC1 1菌剂的研制

以放线菌SC1-1为研究对象,优化该菌株的发酵条件和生产工艺,测定其对茄子黄萎病的温室防治效果。结果表明,该菌株最佳固态发酵工艺为基质(大米粉)中加入玉米秸秆60 mg/g和小米粉30 mg/g,发酵条件为接种量0.4 mL/g、初始含水量400 mg/g、培养时间192 h、初始pH7.6。对茄子黄萎病的防效达到64%,高于对照多菌灵处理。     

牛HSFl和HSBPl基因多态性分析

利用DNA测序技术对牛HSFl和HSBPl进行SNPs位点扫描,共发现4个新SNPs,包括HSFl 1451(G/T)位点、HSBP1第二内含子324(G/C)、589(C/T)和651(C/G)位点.利用CRS-PCR和PCR-RFLP技术对867头荷斯坦牛、85头鲁西黄牛和28头渤海黑牛进行基因多态性分析.X2检验表明,HSFl 1 451(G/T)位点和HSBPl 589(C/T)位点在荷斯坦牛和鲁西黄牛群体中已达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而HSBPl 324(G/C)和651(C/G)位点的突变在荷斯坦牛群中均未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).HSFl 1 451位点(G/T)AA基因型频率最高,优势等位基因为A,而HSBPl 3个SNPs频率最高的基因型分别为AB、AA和BB,589(C/T)位点的优势等位基因为A,而324(G/C)和651(C/G)位点均为B.HSBP1 651(C/G)位点不同基因型的分布在三个牛品种中存在差异,在荷斯坦牛中AA型频率最低,而在鲁西黄牛和渤海黑牛中AA型频率最高,推测该基因型与耐热性有关.该结果将为奶牛耐热分子育种提供理论参考.