不同分割液对水牛胚胎分割效果的影响

探讨了3种不同分割液PBS、PBS+0.2 mol/L蔗糖和PBS+5%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)对水牛胚胎分割效果的影响。借助显微操作仪,将体外受精培养的水牛桑椹胚(第5天)和囊胚(第6～7天)分割,体外培养半胚,观察其发育情况。结果显示:在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割桑椹胚,其分割成功率显著高于PBS(71.67%,67.26%,55.44%)(P<0.05),而半胚的囊胚发育率及囊胚细胞数三者均无差异显著性(P>0.05);在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割囊胚,其分割成功率显著高于PBS(79.13%,76.73%,65.25%)(P<0.05),而半胚培养的囊胚发育率及囊胚细胞数三者差异均无显著性(P>0.05)。说明在PBS中分别添加0.2 mol/L的蔗糖和5%的PVP有利于提高水牛桑椹胚和囊胚的分割成功率。     

不同分割液对奶牛不同阶段胚胎分割效果的影响

本试验探讨了3种不同分割液对奶牛桑葚胚和囊胚分割效果的影响。借助显微操作仪，将发育至第6～8天的体内常规生产的桑葚胚和囊胚进行分割，体外培养半胚，观察其发育情况，选择形态恢复好的半胚与一个囊胚滋养层细胞囊泡（trophoblastic vesicles，TRV）共移植。结果显示，在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割桑葚胚，其分割成功率显著高于PBS（P<0.05），分别为89.13%、86.73%和69.67%，而半胚的囊胚发育率及移植妊娠率三者均无显著差异（P>0.05）；在PBS+0.2 mol/L蔗糖与PBS+5%PVP中分割囊胚， 其分割成功率显著高于PBS（P<0.05），分别为94.52%、92.52%和70.52%，而半胚培养的囊胚发育率及移植妊娠率三者均无显著差异（P>0.05）；说明在PBS中分别添加0.2 mol/L的蔗糖和5%的PVP有利于提高奶牛桑葚胚和囊胚的分割成功率。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

应用1.8mol/L乙二醇+蔗糖冷冻保存奶牛胚胎

以 1 .8 mol/L乙二醇 0 .1 mol/L蔗糖 2 0 ?S-m PBS和 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖 2 0 ?S-m PBS对奶牛胚胎进行了冷冻保存试验 ,并与以 1 .4 mol/L丙三醇 2 0 ?S-m PBS常规冷冻保存奶牛胚胎效果进行了比较。冷冻程序为 -7℃平衡 5min后植冰 ,平衡 1 0 min,然后以 0 .3℃ /min的速率降至 -3 3℃ ,直接浸入液氮中保存。胚胎解冻后的培养结果 ,3组之间的胚胎存活率 ,分别为 80 .0 %( 1 6/2 0 )、90 .5%( 1 9/2 1 )、90 .0 %( 1 8/2 0 ) ,差异不显著 ( P>0 .0 5) ;胚胎的囊胚孵化率 ,1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖组达 81 .0 %( 1 7/2 1 ) ,极显著高于 1 .8mol/L乙二醇 0 .1 mol/L蔗糖组的 3 0 .0 %( 6/2 0 )和 1 .4mol/L丙三醇组的 2 5.0 %( 5/2 0 ) ( P<0 .0 1 )。 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖组冷冻的 A级胚胎和 B级胚胎之间的存活率差异不显著 ( P>0 .0 5) ,但是 A级胚胎的囊胚孵化率 ( 1 0 0 %,1 1 /1 1 )显著高于 B级胚胎( 60 %,6/1 0 ) ( P<0 .0 5)。另外 ,胚胎解冻后透明带断裂对其发育率无影响 ;冷冻前胚胎在 1 .8mol/L乙二醇 0 .0 5mol/L蔗糖液中平衡 1 0 min和平衡 2 0 min,冷冻解冻后培养发育率差异不显著 ( P>0 .0 5)。试验结果表明 ,应用 1 .8mol/L乙二醇 0 .0     

水牛冷冻胚胎分割效果的初步研究

探讨了胚胎分割前后冷冻和不同时期的冷冻胚胎对水牛胚胎分割效果的影响。结果:冷冻后分割组的分割成功率与分割后冷冻组差异不显著(71.39%vs 71.43%,P>0.05),但囊胚冷冻后分割组的半胚发育率显著高于分割后冷冻组(58.33%vs 47.14%,P<0.05);扩张囊胚的冷冻存活率显著高于孵化囊胚(94.84%vs 79.01,P<0.05),但囊胚与孵化囊胚差异不显著(92.67%vs 79.01%,P>0.05),囊胚、扩张囊胚和孵化囊胚冷冻胚胎的分割成功率(70.76%,73.22%,70.92%)及半胚发育率差异均不显著(53.07%,51.49%,57.99%)(P>0.05)。上述结果说明,水牛囊胚冷冻后分割比分割后冷冻能获得更高的半胚发育率;水牛未扩张囊胚和扩张囊胚的冷冻存活率比孵化囊胚高,且这3个时期的冷冻胚胎均适合分割。     

山羊冻胚分割试验

将冷冻-解冻后的琼脂包被孵出胚泡分两组,分别置于12％蔗糖液(A)和磷酸缓冲液(B)中进行2分切割。在体外培养12小时后,A、B两组的半胚发育率分别为68.9％(31/45)和58.3％(35/60)。A组的冻胚分割效果显著好于B组(P<0.05)。将早期囊胚、扩张囊胚、孵出胚泡和琼脂包被孵出胚泡冷冻-解冻后,在12％蔗糖液中分割为2(A、B、C、D组)。在体外培养12～24小时后,A、B、C、D4组的半胚发育率分别为47％(14/30)、 50％(15/30)、27％(8/30)和70％(21/30)。D组的冻胚分割效果显著好于A、B两组(P<0.05)极显著地好于C组(P<0.01)。将5枚在冷冻前用琼脂包被的孵出胚泡在12％蔗糖液中分割为二后移植于5只受体,结果有4只妊娠,共产半胚羔6只,其中2对为同卵双生。本研究证明,在蔗糖液中分割冻胚可提高半胚体外成活率;分割从琼脂释放出的解冻孵出胚泡可提高山羊冻胚分割的效果。     

不同离心液对猪孤雌激活胚胎的冷冻效果

以猪孤雌激活胚胎为材料,经体外成熟、电激活,选取电激活后3d(6⁸cell)胚胎分别放入0.28mol/L的蔗糖离心液或无蔗糖离心液中离心处理后,继续培养5d,取扩张囊胚进行玻璃化冷冻保存。结果显示,在囊胚形成率上,无蔗糖组(19.86%)略高于蔗糖组(18.83%),差异不显著(P>0.05);胚胎复苏率上两者差异不显著,但蔗糖组(43.33%)明显好于无蔗糖组(29.63%);在解冻后胚胎内细胞破损率上,无蔗糖组(20.18%)低于蔗糖组(29.13%),差异不显著(P>0.05)。因此,离心液中添加蔗糖,对后续囊胚形成无影响,在一定程度上提高了解冻囊胚复苏率,但没有降低内细胞的破损程度。     

不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的研究

本研究采用不同来源的体外生产胚胎(屠宰场卵巢IVF胚胎,OPU-IVF胚胎,SCNT胚胎),系统研究了不同冷冻方法对水牛体外生产胚胎冷冻效果的影响,以完善水牛体外生产胚胎冷冻方法,进一步提高胚胎冷冻效果。试验选用6～7日龄囊胚分别用不同的冷冻液和不同冷冻方法进行胚胎冷冻。玻璃化冷冻液分别为40%EG、25%EG+25%DMSO和20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖;程序化冷冻液分别为10%甘油和0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA。结果表明:(1)在玻璃化冷冻中,无论何种胚胎不同冷冻液的冷冻效果有明显的差异,但均以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液的冷冻效果最好,并且高于程序化冷冻的存活率;而对于程序化冷冻,用10%甘油作为冷冻液,屠宰场卵巢IVF胚胎的冷冻后存活率略高于用0.05 mol/L海藻糖+1.8 mol/L EG+0.4%BSA的冷冻后存活率,但差异不显著(P>0.05)。(2)VF胚胎利用程序化冷冻胚胎解冻后,在0～24 h内有76.5%胚胎复活,高于玻璃化冷冻的复苏率(48.9%)(P<0.05);而与此相反,在24～48 h内,玻璃化冷冻胚胎的复苏率(42.6%)则高于程序化冷冻(23.5%)(P<0.05)。综上所述,各种来源的水牛体外生产胚胎均可进行冷冻保存,应用玻璃化冷冻的效果好于程序化冷冻,且以20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L蔗糖作为冷冻液进行玻璃化冷冻效果最好,但程序化冷冻后的胚胎复苏速度明显快于玻璃化冷冻的速度。     

猪植入前胚胎体外培养条件的优化

探讨了更换胚胎培养液及添加FBS、高渗透压和不同浓度VE对猪卵母细胞体外受精(IVF)和孤雌激活(PA)胚胎体外发育的影响,进一步优化了猪植入前胚胎体外培养体系。试验一：在第2天、第4天更换新的培养液(换液组),在换液基础上第4天更换为添加10%FBS的培养液(FBS组)。试验二：胚胎分别在0.05 mol/L蔗糖(蔗糖组)和138 mmol/L氯化钠(氯化钠组)的PZM-3(300～320 mOsmol)中培养2 d后移至PZM-3(288 mOsmol)中培养5 d。试验三：在培养液中分别添加50、100和200 μmol/L VE。对照组均在PZM-3(288 mOsmol)中培养7 d。结果表明：试验一,IVF和PA胚胎FBS组囊胚率显著高于对照组和换液组(P<0.05);试验二,IVF胚胎氯化钠组卵裂率、囊胚率均显著高于对照组与蔗糖组(P<0.05);试验三,IVF胚胎添加100 μmol/L VE组囊胚率显著高于对照组(P<0.05)。结果提示,在换液的基础上添加FBS有利于猪IVF和PA胚胎的体外发育;氯化钠调节的高渗透压可以促进猪IVF胚胎的早期发育;添加100 μmol/L VE可以改善猪IVF胚胎的体外发育体系。     

水牛徒手克隆胚胎培养及冷冻条件的优化

本试验利用微滴、微穴和平板培养系统对徒手克隆(hand-made clone,HMC)重组胚进行体外培养;采用了40% EG(ethylene glycol,EG)、25% EG＋25% DMSO(dimethylsulphoxide,DMSO) 和20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为玻璃化冷冻液对HMC囊胚进行了超低温冷冻;并且比较了HMC与传统核移植的胚胎生产效率及囊胚冷冻存活率。结果表明,微穴系统的卵裂率要显著高于平板系统(P<0.05),极显著高于微滴系统(P<0.01);且微穴系统的囊胚率(40.0%)极显著高于平板(19.8%)和微滴系统(8.3%)(P<0.01)。采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖作为冷冻保护剂时HMC囊胚存活率极显著高于40% EG(P<0.01);HMC重组胚的融合率和囊胚率均高于传统核移植法(P<0.05;P<0.01),而HMC囊胚的冷冻存活率与传统核移植生产的囊胚没有显著差异。以上结果说明水牛HMC可以替代传统核移植法生产克隆胚胎,微穴体系最适合水牛HMC胚胎的体外培养,且采用20% EG＋20% DMSO＋0.5 mol/L蔗糖对HMC囊胚进行玻璃化冷冻可以取得良好的冷冻效果。     

牛胚胎玻璃化超快速冷冻一步法移植试验

应用 30 %乙二醇 0 .3mol/ L 蔗糖 - m- PBS液 (VS1)、30 %乙二醇 0 .3m ol/ L 蔗糖 5 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m-PBS液 (VS2 )、30 %乙二醇 0 .3mol/ L蔗糖 10 %葡聚糖 (T- 5 0 0 ) - m- PBS液 (VS3)玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎 ,一步法移植。结果显示 ,VS1、VS2、VS3组玻璃化超快速冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率分别为 10 0 % (2 0 / 2 0 )、95 %(19/ 2 0 )和 5 5 .6 % (5 / 9) ;培养存活率分别为 70 % (14 / 2 0 )、75 % (15 / 2 0 )和 2 2 .2 % (2 / 9) ;囊胚孵化率分别为 0、2 0 % (4/2 0 )和 0。VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的形态正常率极显著地高于 VS3组 (P<0 .0 1) ;VS1、VS2组玻璃化冷冻奶牛胚胎解冻后的培养存活率分别显著 (P<0 .0 5 )和极显著 (P<0 .0 1)地高于 VS3组。 VS1组冷冻的胚胎经一步法移植了 5头 (1枚 /头 ) ,未获得妊娠 (0 / 5 ) ;VS2组冷冻的胚胎用一步法移植了 10头 (1枚 /头 ) ,结果获得 2头妊娠(2 / 10 ) ,并产下 2头正常犊牛。     

奶牛胚胎分割试验

本试验采集奶牛７日龄胚胎，应用显微操作仪０．２Ｍ蔗糖ＰＢＳ液中分割胚胎。结果获得８９．７％的（Ａ、Ｂ级）胚胎分割成功率，Ａ、Ｂ、Ｃ级胚胎的分割成功率分别为９６．２％，７５．４％、３２．１％，增加可用胚率分别为９２．５％，５０．８％、７．１％，两项指标三者Ａ均差异极显著（Ｐ＜０．０１），以分割Ａ、Ｂ级胚胎效果较好，胚胎发育阶段不影响胚胎分割成功率，操作者的分割技术熟练程度显著影响胚胎分割成功率。     

不同胚胎类型对绵羊胚胎移植效果的影响

为了进一步提高并稳定绵羊胚胎移植的效率,本文对影响绵羊胚胎移植效果的胚胎因素进行了分析。结果表明:三种类型胚胎的移植妊娠率,分别为鲜胚组59.46%、自制冻胚组21.43%、进口冻胚组35.48%,鲜胚组与两冻胚组妊娠率差异均显著(P0.05),两冻胚组差异不显著(P0.05)。在绵羊胚胎移植中,原核胚的移植效果远远低于囊胚移植效果。     

波尔山羊超数排卵和胚胎冷冻技术的初步研究

在山东省东营市正农高科技农业园养殖场进行了波尔山羊超数排卵、胚胎冷冻试验。结果显示:放CIDR的供体与自然发情相比较,其超排效果无明显差异(P>0.05),说明CIDR是一种行之有效的超排方法;在常规胚胎冷冻过程中,鲜胚质量是影响冻胚成活率的主要因素;采用蔗糖解冻冷冻胚胎时,其浓度0.5mol/L和1.0mol/L均获得较高的解冻胚胎成活率。     

咖啡因和Scriptaid对绵羊核移植重构胚发育的影响

为提高绵羊体细胞核移植效率,以绵羊卵丘细胞为核供体,在融合后的核质互作期间加入咖啡因,在激活后对重构胚进行培养的过程中,加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid。结果表明:咖啡因浓度以2.5 mmol/L或5 mmol/L为宜,尽管卵裂率、桑椹胚率以及囊胚发育率与对照组差异不显著(P>0.05),但囊胚细胞数显著高于对照组(P<0.05);以0.2μmol/L Scriptaid处理组囊胚发育率最高,达24.31%,显著高于对照组和0.8μmol/L Scriptaid处理组(P<0.05),但与0.4μmol/L Scriptaid处理组相比差异不显著(P>0.05);囊胚细胞总数以0.2μmol/L Scriptaid处理组最高,显著高于0.8μmol/L Scriptaid处理组(P<0.05),但是与对照组和0.4μmol/L Scriptaid处理组差异不显著(P>0.05)。以上结果表明,咖啡因处理对绵羊核移植重构胚的囊胚发育率无显著影响,但可以显著提高囊胚细胞总数;Scriptaid可以显著提高绵羊核移植重构胚的囊胚发育率。     

绵羊玻璃化冷冻胚胎直接移植试验研究

应用EFS40玻璃化液对6.5～7日龄的绵羊胚胎进行玻璃化冷冻及解冻后直接移植试验.结果:桑椹胚、囊胚冷冻解冻后移植的妊娠率分别为37.50%(3/8)和54.55%(6/11),胚胎存活率分别为33.33%(3/9)和50.00%(6/12),差异均不显著(P＞0.05);胚胎解冻后用0.5 mol/L蔗糖脱防冻剂与直接用胚胎存放液脱除防冻剂的妊娠率分别为44.44%(4/9)和50.00%(5/10),胚胎存活率分别为40.00%(4/10)、45.45%(5/11)差异不显著(P＞0.05);10枚解冻后的胚胎细管内脱防冻剂后,直接装管移植给8只受体,妊娠率为50.00%(4/8),胚胎成活率为40.00%(4/10),与同期常规冷冻解冻组相比无显著差异(P＞0.05).     

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。     

在蔗糖液中分割解冻后的牛胚胎

用常规方法将7日龄牛胚胎冷冻,在37℃水中解冻,一步法除去甘油.将一部分胚胎放在 PBS 液中,一部分放在12.5%蔗糖液(455毫渗摩)+20%牛血清中.显微操作时放大100倍,轻度吸引固定。用显微刀片切开透明带,分割胚胎成两半胚。将分割后的两半胚留在透明带里或裸露,进行体外培养24～72小时或非手术移植给青年母牛。结果,仍留在透明带里的两半胚移植妊     

不同离心液对猪孤雌激活胚胎的冷冻效果

以猪孤雌激活胚胎为材料，经体外成熟、电激活，选取电激活后3d（6--8cell）胚胎分别放入0．28mol／L的蔗糖离心液或无蔗糖离心液中离心处理后，继续培养5d，取扩张囊胚进行玻璃化冷冻保存。结果显示，在囊胚形成率上，无蔗糖组（19．86％）略高于蔗糖组（18．83％），差异不显著（P〉0．05）；胚胎复苏率上两者差异不显著，但蔗糖组（43．33％）明显好于无蔗糖组（29．63％）；在解冻后胚胎内细胞破损率上，无蔗糖组（20．18％）低于蔗糖组（29．13％），差异不显著（P〉0．05）。因此，离心液中添加蔗糖，对后续囊胚形成无影响，在一定程度上提高了解冻囊胚复苏率，但没有降低内细胞的破损程度。     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响

为研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响，本试验利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0（对照组）、0.2、0.5、1.0 μmol/L生物素处理，分别在12、24与48 h时检测细胞上清液中甘油释放量、脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）、脂滴包被蛋白A （perilipin A）及脂肪分化相关蛋白（ADRP）相对表达量。结果显示，在12 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组HSL基因mRNA相对表达量显著低于对照组（P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A、ADRP基因mRNA相对表达量均极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；在24 h时，各试验组甘油释放量、1.0 μmol/L组ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于其他组（P<0.01）；在48 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著或显著低于对照组（P<0.01；P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.05），0.5、1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于对照组（P<0.01）。综上所述，生物素可通过促进perilipin A与ADRP表达，同时抑制ATGL与HSL表达，达到抑制脂肪分解的效果，且浓度为1.0 μmol/L时效果最佳。