不同离心液对猪孤雌激活胚胎的冷冻效果

以猪孤雌激活胚胎为材料，经体外成熟、电激活，选取电激活后3d（6--8cell）胚胎分别放入0．28mol／L的蔗糖离心液或无蔗糖离心液中离心处理后，继续培养5d，取扩张囊胚进行玻璃化冷冻保存。结果显示，在囊胚形成率上，无蔗糖组（19．86％）略高于蔗糖组（18．83％），差异不显著（P〉0．05）；胚胎复苏率上两者差异不显著，但蔗糖组（43．33％）明显好于无蔗糖组（29．63％）；在解冻后胚胎内细胞破损率上，无蔗糖组（20．18％）低于蔗糖组（29．13％），差异不显著（P〉0．05）。因此，离心液中添加蔗糖，对后续囊胚形成无影响，在一定程度上提高了解冻囊胚复苏率，但没有降低内细胞的破损程度。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

不同发育天数及囊胚类型对猪孤雌激活胚胎冷冻效果的研究

实验比较不同发育天数所得的早期囊胚和扩张囊胚的冷冻效果,以期找出冷冻前胚胎最佳发育时期及囊胚类型。以猪孤雌激活胚胎为材料,分别取培养到第5、6、7天所得的早期囊胚(EB)和扩张囊胚(B)进行玻璃化冷冻保存,解冻后对其复苏率和内细胞团数损伤进行观察和统计。结果表明:发育第5天所获早期囊胚和扩张囊胚复苏率(32.26%、44.78%)好于第6天(22.45%、35.09%)和第7天(8.33%、32.65%),各发育天数所获扩张囊胚复苏率差异不显著(P>0.05),发育至第5天和6天的早期囊胚复苏率显著高于第7天(P<0.05);在内细胞团损伤比例上,虽各组差异不显著(P>0.05),但第5天和第6天组损伤低于第7天组。结果提示,在孤雌激活后第5天选取扩张囊胚进行冷冻,解冻后所得冷冻效果好。     

不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

研究了猪体外成熟卵母细胞的电激活、离子霉素激活和乙醇激活的方法。3种不同激活方法筛选试验表明,猪卵母细胞电激活最佳参数为电场强度130V/min,脉冲时程80μs的1次脉冲激活,即130V/mm-80μs-1次,其囊胚(发育)率为18.92%±8.48%(P>0.05);离子霉素激活的最佳条件为15μmol/L、激活时间40min,其囊胚率为21.27%±8.54%(P>0.05);乙醇激活最佳参数以9%乙醇激活处理3min,囊胚率为13.33%±7.64%。进一步对比试验表明,电激活和离子霉素激活处理的囊胚率和囊胚细胞数无显著差异(P>0.05),电激活的卵裂率明显高于乙醇激活(P<0.05),而囊胚率和细胞数差异不显著(P>0.05)。     

离心去脂处理对不同发育阶段猪孤雌激活胚胎冷冻保存效果的影响

通过对不同发育阶段猪孤雌激活胚胎进行离心去脂处理，比较胚胎冷冻效果，优化冷冻体系。以猪孤雌激活胚胎为材料，比较实施电激活后第1天（2～3细胞）、第2天（4～6细胞）、第3天（6～8细胞）进行离心处理，取培养到第6天所得到扩张囊胚进行玻璃化冷冻保存，未离心处理直接进行冷冻的胚胎作为对照组。结果显示第3天离心组和第2天离心组所得的囊胚形成率（30．23％，28．22％）虽好于第1天离心组和不处理组（21．73％，22．43％），但4个试验组差异不显著（P〉0．05）；第3天离心组和第2天离心组的冷冻后胚胎复苏率（28．57％，20．56％）显著高于不处理组（7．73％）、第1天离心组（12．24％），差异显著（P〈0．05）；第3天离心组的解冻后囊胚内细胞计数（30．40）显著高于对照组（18．25）、第1天离心组（16．60），差异显著（P〈0．05），高于第2天处理组（23．71），但差异不显著（P〉0．05）。结果表明，在孤雌激活后第3天进行离心处理，对胚胎发育到囊胚没有影响，且进行冷冻后所得复苏率及胚胎内细胞团数较好。     

绵羊玻璃化冷冻胚胎直接移植试验研究

应用EFS40玻璃化液对6.5～7日龄的绵羊胚胎进行玻璃化冷冻及解冻后直接移植试验.结果:桑椹胚、囊胚冷冻解冻后移植的妊娠率分别为37.50%(3/8)和54.55%(6/11),胚胎存活率分别为33.33%(3/9)和50.00%(6/12),差异均不显著(P＞0.05);胚胎解冻后用0.5 mol/L蔗糖脱防冻剂与直接用胚胎存放液脱除防冻剂的妊娠率分别为44.44%(4/9)和50.00%(5/10),胚胎存活率分别为40.00%(4/10)、45.45%(5/11)差异不显著(P＞0.05);10枚解冻后的胚胎细管内脱防冻剂后,直接装管移植给8只受体,妊娠率为50.00%(4/8),胚胎成活率为40.00%(4/10),与同期常规冷冻解冻组相比无显著差异(P＞0.05).     

不同激活方法对金华猪单精注射胚胎体外发育的影响

本试验用新鲜精子和冷冻精子比较了不同激活方法对金华猪单精注射(ICSI)胚胎体外发育的影响。结果显示:不同激活处理组与对照组比较,在卵裂率上差异均不显著(P0.05),但在囊胚率上,电+化学激活组、电激活组与对照组、化学激活组比较,差异显著(P0.05)。电+化学激活组与电激活组在囊胚率上差异不显著(P0.05),对照组与化学激活组在囊胚率上差异不显著(P0.05)。新鲜精液和冷冻精液经ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上均无显著差异(P0.05)。电+化学激活和电激活都可用于金华猪ICSI体外胚胎生产的激活方法。     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

主要比较了离子霉素、电脉冲及培养基更换对牛羊体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。两种方法对牛胚胎的研究中,牛胚胎卵裂率无显著差异(90.61%vs94.40%,P>0.05),而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法(12.3%vs2.4%,P<0.01)。两种方法对羊胚胎的研究中,羊胚胎卵裂率无显著差异(72.4%vs77.4%,P>0.05)。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法(3.67%vs10.4%,P<0.05)。本试验还采用两种方法来培养牛化学激活孤雌胚。方法一是把化学激活牛体外成熟卵母细胞放于SOFaa(Synthetic Oviduct Fluid aa)培养基中连续培养7d;方法二是把化学激活牛体外成熟卵母细胞放于SOFaa培养基中4 d后,再转移进入含有10?S(Fetal Bovine Serum)的SOFaa培养基中继续培养3 d。试验结果表明:方法一中的囊胚发育率显著高于方法二(11.64%vs3.49%,P<0.01)。这也说明了更换培养基不利于其体外囊胚发育率。     

水牛卵母细胞玻璃化冷冻保存

以水牛MII期的卵母细胞为材料,利用玻璃化冷冻液EDS33(16.5%EG+16.5%DMSO+sucrose)对水牛MII期的卵母细胞进行两步法(玻璃毛细管(GMP)和拉细的开口塑料细管(OPS))玻璃化冷冻保存,即卵母细胞首先放入预平衡液(7.5%EG+7.5%DMSO+sucrose)中平衡3 min,再移入玻璃化冷冻液中30 s后装管直接投入液氮.解冻是在蔗糖浓度逐渐降低的解冻液中进行的.解冻后存活的卵母细胞孤雌激活,通过囊胚发育率作为评定卵母细胞冷冻效果的指标.结果发现,GMP和OPS法冷冻保存的水牛卵母细胞解冻后的存活率(分别为96.80%和97.41%)与对照组卵母细胞的存活率(100%)3者之间差异均不显著(P>0.05).GMP法和OPS法冷冻的水牛卵母细胞激活后的胚胎分裂率和囊胚发育率2者均明显低于对照组(分别为30.58%和28.32% vs50.94%,10.81%和9.38% vs 29.63%,P<0.05),而这2种方法冷冻的水牛卵母细胞激活后的分裂率和囊胚发育率差异均不显著(P>0.05).这表明GMP和OPS玻璃化冷冻方法可以用于水牛卵母细胞的冷冻,并且玻璃化冷冻的卵母细胞能继续分裂并发育到囊胚.     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P<0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P>0.0 5);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P<0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。