雌激素调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡及生长周期作用机制的研究

试验旨在研究雌激素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡及生长周期的影响。通过添加MAPK/ERK信号通路阻断剂探索雌激素调控BMECs凋亡及生长周期具体的作用机制,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化情况,实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Caspase3及CyclinD1基因mRNA的表达丰度。结果显示,对照组BMECs凋亡率极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),Bcl-2 mRNA表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01),Caspase3 mRNA表达丰度显著低于BMECs+PD98059组(P0.05);对照组细胞比例在G1期显著高于BMECs+E_2组(P0.05),极显著低于BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),S期细胞比例极显著高于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),G2期细胞比例极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01);对照组CyclinD1 mRNA的表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01);BMECs+E_2+PD98059组的Bcl-2 mRNA的表达量极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01),Caspase3 mRNA的表达量显著低于BMECs+PD98059组(P0.05)。结果表明,MAPK/ERK信号通路参与BMECs的增殖及细胞生长周期调节的过程,且雌激素可通过MAPK/ERK信号通路抑制BMECs的凋亡,MAPK/ERK信号通路可能参与由雌激素调控的细胞生长周期的进程。     

雌激素调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡及生长周期作用机制的研究

试验旨在研究雌激素对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）凋亡及生长周期的影响。通过添加MAPK/ERK信号通路阻断剂探索雌激素调控BMECs凋亡及生长周期具体的作用机制,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化情况,实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Caspase3及CyclinD1基因mRNA的表达丰度。结果显示,对照组BMECs凋亡率极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,Bcl-2 mRNA表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）,Caspase3 mRNA表达丰度显著低于BMECs+PD98059组（P<0.05）;对照组细胞比例在G1期显著高于BMECs+E₂组（P<0.05）,极显著低于BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,S期细胞比例极显著高于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）,G2期细胞比例极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E₂+PD98059组（P<0.01）;对照组CyclinD1 mRNA的表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）;BMECs+E₂+PD98059组的Bcl-2 mRNA的表达量极显著高于BMECs+PD98059组（P<0.01）,Caspase3 mRNA的表达量显著低于BMECs+PD98059组（P<0.05）。结果表明,MAPK/ERK信号通路参与BMECs的增殖及细胞生长周期调节的过程,且雌激素可通过MAPK/ERK信号通路抑制BMECs的凋亡,MAPK/ERK信号通路可能参与由雌激素调控的细胞生长周期的进程。     

IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白表达的影响

为了研究外源添加不同浓度的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳脂和乳蛋白含量的影响,试验选取生长状态良好的第三代乳腺上皮细胞进行培养,试验组添加浓度分别为25,50,75μg/m L的IGF-Ⅰ,对照组仅添加与试验组等体积的完全培养基,用高效液相色谱法检测乳用三酰甘油的表达量,用Western-blot法测定培养12,24,48,72小时时的细胞乳蛋白中α-酪蛋白和κ-酪蛋白的表达量。结果表明:添加25μg/m L IGF-Ⅰ的试验Ⅰ组,细胞乳脂表达极显著高于对照组及其他试验组(P0. 01);试验组乳蛋白的表达均显著或极显著高于对照组(P0. 05或P0. 01)。说明IGF-Ⅰ对BMECs乳脂和乳蛋白的表达具有一定促进作用。     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白和甘油三酯表达的影响

为探讨雌激素对乳腺上皮细胞中酪蛋白及甘油三酯表达的影响,试验于2018年2月至2018年4月在新疆肉乳用草食动物营养实验室进行,实验选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞,添加0、50、100、200μmol/l雌激素孵育乳腺上皮细胞后,分别在12、24、48、72 h后检测各组细胞酪蛋白及甘油三酯表达的情况。结果显示,在12 h时,添加50μmol/l雌激素组CSN1的表达量极显著高于对照组(P<0.01),添加50μmol/l雌激素组TG表达量极显著高于对照组(P<0.01);50μmol/l雌激素添加组CSN1表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),且极显著高于100μmol/l雌激素添加组(P<0.01),100μmol/l雌激素添加组CSN2表达量显著高于200μmol/l雌激素添加组(P<0.05),50μmol/l雌激素添加组TG表达量极显著高于100、200μmol/l雌激素添加组(P<0.01);添加50μmol/l雌激素时,12、48、72 h的CSN1表达量显著高于24 h(P<0.05),在72 hCSN2表达量显著高于其他各时间点(P<0.05),24、72 h时TG表达量显著高于12、48 h(P<0.05)。结果发现,添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞中CSN1、CSN2及TG的表达。200μmol/l在一定条件下促进CSN1的表达效果最好;100、200μmol/l雌激素添加组均能够促进CSN2的表达,且100μmol/l促进CSN2的表达效果最好,尤其是在12、24 h;50、200μmol/l雌激素添加组可以促进TG的表达,但100μmol/l雌激素添加组能够抑制TG的表达。     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期变化规律的影响

目的 研究雌激素对乳腺上皮细胞增殖及细胞生长周期变化规律的影响。方法 选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞,添加0、50、100、200 μmol/L雌激素孵育乳腺上皮细胞后,分别在0、12、24、48、72 h后检测各组细胞增殖及细胞周期。结果 培养12 h时,50 μmoL/L雌激素组的OD值显著高于对照组及100 μmoL/L雌激素组(P＜0.05),且极显著高于200 μmoL/L雌激素添加组(P＜0.01);培养至12 h时,对照组及添加50 μmoL/L雌激素组其G1期极显著高于其他两组(P＜0.01),对照组S期极显著高于其他各组(P＜0.01),添加100 μmoL/L雌激素组其G2期极显著高于其他各组(P＜0.01)。结论 添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞的增殖,且50 μmoL/L、12 h时雌激素促进乳腺上皮细胞的增殖效果最好。添加雌激素不影响乳腺上皮细胞在各时期时细胞生长的基本规律,各雌激素添加组在12 h时的细胞周期由G1、S期向G2期转化较快。     

脐带间充质干细胞通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ介导的Janus激酶/信号转导及转录活化因子信号通路抑制奶牛乳腺上皮细胞凋亡的体外研究

本试验旨在探究Janus激酶/信号转导及转录活化因子(JAK/STAT)信号通路是否参与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抑制奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡的调节。将UC-MSCs和BMECs利用TranswellTM小室双层共培养,以BMECs单纯培养为对照,给予类胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)抑制剂AG1024进行干预,并用信号阻断剂AG490处理细胞,24 h后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)基因的相对表达丰度,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明:UC-MSCs和BMECs共培养组BMECs的凋亡率极显著低于其他各组(P0.01);UC-MSCs和BMECs共培养组Bcl-2基因的相对表达丰度较BMECs组极显著上调(P0.01),Caspase-3、Bax基因的相对表达丰度则显著或极显著下调(P0.05或P0.01);AG1024和AG490单独处理或二者共同处理升高了单独培养的BMECs和与UC-MSCs共培养的BMECs的凋亡率,并上调了Bax、Caspase-3基因的相对表达丰度,下调了Bcl-2基因的相对表达丰度,均具有统计学意义(P0.05或P0.01)。由此得出,UC-MSCs能够通过IGF-Ⅰ介导JAK/STAT信号通路调节BMECs凋亡相关基因的表达,降低BMECs的凋亡率。     

添加通路阻断剂对IGF-1影响奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的研究

试验旨在研究胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）对奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）增殖的影响,为后期利用IGF-1调控乳腺发育奠定理论基础。以奶牛乳腺上皮细胞为材料,首先分4组分别外源添加0（对照组）、10、50、100 μg/mL IGF-1且分别培养12、24、48、72 h,测定抑制BMECs凋亡率的最佳浓度;然后分6组：单纯BMECs组、BMECs+IGF-1组、BMECs+LY294002组、BMECs+IGF-1+LY294002组、BMECs+RAPA组和BMECs+IGF-1+RAPA组,采用流式细胞术测定各组细胞凋亡率。结果表明,外源性添加IGF-1对BMECs凋亡率具有抑制作用,最佳浓度为50 μg/mL;BMECs+IGF-1+LY294002与BMECs+IGF-1+RAPA组细胞凋亡率均极显著高于BMECs+IGF-1组（P<0.01）。推断IGF-1能够活化PI3K/Akt/mTOR信号通路,参与BMECs凋亡的调控作用,进而抑制BMECs细胞凋亡;IGF-1可能会对被抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路产生"修复"机制,使其能够重新参与BMECs的生命进程。     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响

为研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响，本试验利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0（对照组）、0.2、0.5、1.0 μmol/L生物素处理，分别在12、24与48 h时检测细胞上清液中甘油释放量、脂肪甘油三酯水解酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）、脂滴包被蛋白A （perilipin A）及脂肪分化相关蛋白（ADRP）相对表达量。结果显示，在12 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组HSL基因mRNA相对表达量显著低于对照组（P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A、ADRP基因mRNA相对表达量均极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；在24 h时，各试验组甘油释放量、1.0 μmol/L组ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组（P<0.01），0.5、1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量极显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.01）；1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于其他组（P<0.01）；在48 h时，1.0 μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著或显著低于对照组（P<0.01；P<0.05），1.0 μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量显著高于对照组与0.2 μmol/L组（P<0.05），0.5、1.0 μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于对照组（P<0.01）。综上所述，生物素可通过促进perilipin A与ADRP表达，同时抑制ATGL与HSL表达，达到抑制脂肪分解的效果，且浓度为1.0 μmol/L时效果最佳。     

不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响

为研究不同生物素水平对3T3-L1脂肪细胞脂肪分解及相关基因表达的影响,本试验利用三联诱导法将3T3-L1细胞经诱导分化为3T3-L1脂肪细胞。当3T3-L1脂肪细胞密集后分别采用0(对照组)、0.2、0.5、1.0μmol/L生物素处理,分别在12、24与48h时检测细胞上清液中甘油释放量、脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、脂滴包被蛋白A(perilipin A)及脂肪分化相关蛋白(ADRP)相对表达量。结果显示,在12h时,1.0μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组(P0.01),0.5、1.0μmol/L组HSL基因mRNA相对表达量显著低于对照组(P0.05),1.0μmol/L组perilipin A、ADRP基因mRNA相对表达量均极显著高于对照组与0.2μmol/L组(P0.01);在24h时,各试验组甘油释放量、1.0μmol/L组ATGL基因mRNA相对表达量均极显著低于对照组(P0.01),0.5、1.0μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量极显著高于对照组与0.2μmol/L组(P0.01);1.0μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于其他组(P0.01);在48h时,1.0μmol/L组甘油释放量、ATGL基因mRNA相对表达量均极显著或显著低于对照组(P0.01;P0.05),1.0μmol/L组perilipin A基因mRNA相对表达量显著高于对照组与0.2μmol/L组(P0.05),0.5、1.0μmol/L组ADRP基因mRNA相对表达量极显著高于对照组(P0.01)。综上所述,生物素可通过促进perilipin A与ADRP表达,同时抑制ATGL与HSL表达,达到抑制脂肪分解的效果,且浓度为1.0μmol/L时效果最佳。