黄龙病菌在柑橘枝条上的分布和多样性分析

 柑橘黄龙病是由“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)引起的毁灭性病害,在染病植株的叶片和果实上表现出不同症状。但目前还未见在同一植株或枝条上表现不同症状的叶片或果实中的CLas是否存在多样性的报道。本研究分析来自美国佛罗里达与中国广东两地染病柑橘样品,发现佛罗里达的CLas遗传多样性较低。以3对位于CLas短串联重复位点两端的序列为引物,对广东柑橘黄龙病病株的样品进行PCR扩增和PAGE检测,结果发现:同一植株上的CLas多样性高于同一枝条;同一病枝上显不同症状的叶片和果实中的CLas浓度分布不均匀,但成熟病果中CLas的浓度最高。以同一病枝条为一个组,PCR扩增和PAGE检测53个枝条的样品,发现不同组间CLas多样性不一:3对引物扩增条件下分别有4组(7.55%)、7组(13.21%)和11组(20.75%)样品存在组间多样性,推测同一枝条中含有不同的CLas菌株。以上结果说明了CLas在柑橘枝条上的分布规律,为监测我国CLas的多样性提供了科学依据。     

河南省小麦黑胚病优势病原菌链格孢菌(Alternaria spp.)遗传多样性分析

 采用RAPD技术对分离自河南省各地的43株小麦黑胚病优势病原菌(Alternaria spp.)菌株进行了遗传多样性分析。17个随机引物共扩增出151条清晰的DNA条带,所扩增出的DNA条带均为多态带,说明河南省小麦黑胚病菌存在着丰富的遗传多样性。利用NTSYS软件进行了病原菌的聚类分析,结果表明,河南省小麦黑胚病菌主要有2个种,即Alternaria alternata和A. tenuissima,种间的遗传相似系数的变化幅度为0.62~0.92。来自同一个地区的小麦黑胚病菌菌株基本上聚在了一起,表现出很近的亲缘关系,来自不同地区之间的菌株也可以交叉聚类。病原菌遗传多样性分析进一步验证了形态学的鉴定结果。     

不同核盘菌菌株及其近缘种的RAPD分析

 本文利用随机引物扩增多态性DNA (RAPD)技术分析了7个生物学性状差异较大核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的遗传多样性,并同三叶草核盘菌(S.trifoliorum)、小核盘菌(S.minor)的代表性菌株和莴苣上的一种产菌核病原菌的代表菌株Let-19进行了比较。结果表明40个引物中8个引物能稳定地从供试菌株中扩增出多态性DNA片段。通过分析这些多态性片段可以看出7个供试核盘菌菌株之间的遗传相似系数变化幅度为0.505 2~0.793 1,而核盘菌、三叶草核盘菌,小核盘菌和Let-19之间的遗传相似系数的变幅则为0.194 2~0.385 3。莴苣上的菌株Let-19的RA PD图谱同供试其它种的菌株既存在明显差异的DNA片段电泳带,又显示出一些位置一致的DNA片段电泳带。因而Let-19同核盘菌属真菌的亲缘关系较近。供试的引物中OPL14既能介导从供试的7个核盘菌菌株和3个近缘种的3个菌株的DNA样品中扩增出相同的DNA片段,又能扩增出种或菌株特异性DNA片段。因而RAPD技术适于研究核盘菌的遗传多样性及分析核盘菌属真菌的亲缘关系。     

基于原噬菌体类型的我国柑橘黄龙病菌种群遗传结构分析

 柑橘黄龙病是柑橘生产上最严重的病害之一,由难培养的候选韧皮部杆菌亚洲种(“Candidatus Liberibacter asiaticus”, CLas)引起。目前,已报道的与CLas相关的原噬菌体有3种,并且不同的CLas样品中可以检测到不同类型的原噬菌体或不同类型的组合。本研究基于原噬菌体类型特异引物对从我国南方8省收集的548个黄龙病样品进行原噬菌体类型的鉴定和分析。结果表明,基于原噬菌体类型,在548个样品中共鉴定了7种类型的菌株,分别为Type 1(7.12%)、Type 2(60.22%)、Type 3(3.83%)、Type 1+Type 2(3.28%)、Type 1+Type 3(17.34%)、Type 1+Type 2+Type 3(3.47%)和None类型(不含上述3种类型原噬菌体)(4.74%),其中只携带Type 2类型原噬菌体菌株为华南地区优势种群。此外,基于遗传多样性和遗传距离对我国南方地区的CLas种群进行种群结构分析发现,我国南方地区的CLas种群可以分为3个组,即I组(广东、江西、广西、福建)、II组(浙江和湖南)以及III组(云南和海南),其中I组和II组又可聚为一大组。该结果可为研究我国柑橘黄龙病流行规律提供一定的理论基础。     

甘肃省大麦条纹病菌遗传多样性及致病力差异

为了解甘肃省大麦条纹病病原菌Pyrenophora graminea的遗传多样性及致病力差异,运用RAPD分子标记技术对大麦条纹病菌不同菌株进行遗传多样性分析,并采用三明治法进行菌株致病力差异研究。结果表明:17个RAPD标记从45个菌株中扩增出126条带,平均每个标记7.41条带,遗传相似系数范围为0.468 3～0.984 1,平均值为0.830 8,当遗传相似系数为0.723 6时,可将供试菌株划分为4个类群,分别包含41、2、1和1个菌株;致病力测定结果显示菌株QWC较菌株QQ致病力强,两菌株除在品种‘甘啤2号’和‘GP-3’上无致病力外,在其他供试品种上致病力均存在差异。表明大麦条纹病菌不同菌株间存在遗传差异,且菌株QWC和菌株QQ存在致病力差异。     

6个白榆种群遗传多样性的RAPD分析

以科尔沁和浑善达克沙地的6个天然白榆种群为研究对象,采用RAPD分子标记技术,从35条引物中筛选出扩增多态性较多且扩增产物稳定的17条10bp引物。对6个白榆种群的180个叶片样品的基因组DNA进行扩增,共检测到181个位点,多态位点有96个,多态位点百分比为52.89%;不同种群内的遗传多样性水平差异不大,Nei’s多样性指数(h)和Shannon’s多样性指数(I)为0.2611和0.3814,遗传多样性主要存在于种群内;群间的遗传分化系数Gst为0.3768,种群内的遗传变异所占比例为62.32%;6个种群的遗传距离显示,科尔沁沙地和浑善达克沙地白榆各种群间的遗传距离不明显。     

中国不同地区亚洲韧皮杆菌遗传多样性分析

 柑桔黄龙病是最严重的柑桔病害之一,现已威胁世界柑桔产业。已被证实在中国南部该病害通过嫁接和木虱传播。因此黄龙病的流行病学研究就显得尤为重要。本研究中,基于外膜蛋白(omp)基因的PCR-RFLP的方法被用来研究中国南部各柑桔主产区的亚洲韧皮部杆菌的遗传多样性。研究采用不同的限制性内切酶消化各地区的亚洲韧皮部杆菌的omp基因产生了不同的RFLP指纹图谱,并对各地亚洲韧皮部杆菌的omp基因进行克隆测序然后构建系统发育树。结果显示:中国不同地理区域的亚洲韧皮部杆菌具有一定的遗传多样性,即便在某一特定的地区也有一定的差异。序列分析显示中国地区的亚洲韧皮部杆菌有很高的同源性。这些结果对揭示中国柑桔黄龙病的流行病学及制定科学有效的防治策略具有一定的指导意义。     

基于毒性相关基因序列的稻瘟病菌群体遗传多样性分析

 选用16对毒性相关基因特异性引物对四川和重庆9个县(市)分离到的200个稻瘟病菌单孢菌株进行PCR扩增,并采用最长距离法进行聚类分析,结果显示各引物均能扩增出其目的条带,多态位点百分率(P)高达93.75%,扩增频率差异较大;200个菌株可归为70个不同的单元型,其中单元型SCH13为优势单元型;在0.86遗传相似水平上,200个菌株可划分为27个遗传宗谱,包括1个优势宗谱,3个亚优势宗谱,14个次要宗谱,9个小宗谱,层次丰富;在群体平均水平上,病菌群体具有丰富的遗传多样性(H=0.324 4,I=0.484 2),且群体间差异较大;9个种群在遗传距离为0.05水平上可分为4个类群,种群遗传谱系与地理区域分布呈一定相关性。同时,该地区的群体存在一定的遗传分化(HT=0.320 0),群体内多样性大于群体间多样性(Hs=0.179 6,Dst=0.140 4),总遗传变异的56.13%存在于群体内(Gst=0.438 7),群体间基因流动性较小(Nm=0.639 6)。本研究揭示了四川和重庆部分区域稻瘟病菌群体遗传结构、遗传多样性及其与地理分布之间的关系,为抗病育种和品种布局奠定了基础。     

柑橘黄龙病菌亚洲种分子检测引物评价及绝对定量PCR体系优化

柑橘黄龙病是对柑橘产业最具毁灭性的病害, 目前没有可用的有效药剂和抗病品种, 分子检测对黄龙病有效防控至关重要。本研究对国内外常用的常规PCR和巢式PCR检测引物进行评价, 针对多拷贝的nrdB和16S rDNA基因, 构建质粒标准品并筛选适用于绝对定量PCR的最佳质粒。结果表明, 使用Es Taq MasterMix对感染 Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas)的柑橘样品进行常规PCR检测时, 在评价的16对引物中, OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877灵敏度最高, 推荐同时使用检测黄龙病菌含量低的样品;各组巢式PCR检测引物有其适用扩增体系, 部分引物用Es Taq MasterMix扩增时出现非特异性扩增, F1/B1→F3/B3则适用Es Taq MasterMix体系, 且最高可稳定特异检出105倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-3 ng/μL）, 是灵敏度最高的引物组, OI1/OI2c→S3/S4在Es Taq MasterMix和Ex Taq DNA聚合酶体系中均可稳定特异检出104倍稀释感染CLas柑橘总DNA样品（2×10-2 ng/μL）, 是适用扩增体系最广的引物组;构建的5个绝对定量PCR质粒标准品中, pnrdB83扩增效率最接近100%, 且在2次重复试验中波动最小, 稳定性最强, 并且作为标准品对黄龙病待测样品进行绝对定量时, 各样品在2次重复试验中的拷贝数差值最小, 是本研究筛选的最佳质粒。本研究的结果将为柑橘黄龙病菌的定性和定量分子检测提供参考。     

苦瓜枯萎病菌的鉴定及其遗传多样性分析

 对分离获得的32株苦瓜枯萎病菌菌株进行形态学特征和寄主专化型测定, 结果表明, 测试的苦瓜枯萎病菌株均为尖孢镰刀菌苦瓜专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. momordicae), 这些菌株可以侵染苦瓜和瓠瓜幼苗, 但不侵染其他葫芦科瓜类作物。对苦瓜枯萎病菌菌株的rDNA-ITS区 (ITS1、5.8S和ITS2)序列进行扩增测序, 结果显示其序列长度均为456 bp;聚类分析表明测序菌株与镰刀菌属中尖孢镰刀菌不同专化型的菌株聚为一群。利用RAPD标记技术分析苦瓜枯萎病菌的遗传多样性, 结果显示苦瓜枯萎病菌株与其他葫芦科瓜类作物枯萎病菌株间的遗传相似系数范围为0.59~0.99, 当遗传相似系数为0.85时, 供试的48个菌株分成10个类群 (G_1~10)。在RAPD聚类树中所有苦瓜枯萎病菌株聚在一个分支上 (G₁群), 菌株间的遗传相似系数范围为0.92~1.00, 具有较高的遗传相似性, 且菌株的聚群与地理来源存在一定的相关性。     

应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter\|leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd 和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田间侵染情况,结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3 %、17.9 %、10.7 %和28.6 %,接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。     

弯孢类炭疽菌rDNA ITS区的RFLP分析及分类研究

 应用核糖体DNA ITS区的RFLP分析对3 8个不同寄主来源的弯孢类炭疽菌菌株的遗传多样性和系统发育进行研究。结果表明:弯孢类炭疽菌的ITS扩增区(ITS₄~ITS₅)约为650 bp,无长度变异。5种内切酶(Alu I、Bsu RI、Hin 6 I、Hpa Ⅱ和Taq I)的酶切图谱在种内是相似或一致的,而种间差异较大。ITS-RFLP共迁带UPGMA聚类分析的结果表明:3 8个弯孢类炭疽菌菌株被聚为6个类群,群与群之间分界明显,表明种的分界相当明显。ITS-RFLP分析的结果还揭示了一些近似种的分类关系,如,按传统方法分别鉴定为Colletotrichum truncatum、C.circinans和C.capsici的许多菌株有相似或完全一致的内切酶酶切图谱,这些分子特征支持它们为同一个种。     

苹果炭疽病病原菌ISSR-PCR反应体系的优化及遗传多样性分析

为了从分子水平探讨苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性,采用L16 (45)正交设计对ISSRPCR反应体系中的Mg2浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度和DNA含量进行优化,并利用优化的体系进行引物筛选及苹果炭疽病菌遗传多样性分析.确立最优反应体系为2.0mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、2UTaqDNA聚合酶、1μmol/L引物和DNA 100 ng.筛选获得的10条引物对供试菌株共扩增出42条谱带,均为多态性条带.供试菌株在相似系数0.50处分为2个类群,分别与根据形态学鉴定的胶孢刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides和尖孢刺盘孢C.acutatum 2个类群相一致,在相似系数0.74处,分为4个亚群,表明苹果炭疽病菌存在明显的种间及种内遗传分化.     

烟草根黑腐病菌的PCR分子检测

 根据烟草根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)与其它烟草病原真菌核糖体基因转录间隔区(internal transcribed spa-cer,ITS)序列间的差异,设计了一对特异性引物TB-5/TB-3,用于T. basicola的分子检测。利用该对引物对包括T. basicola在内的13个烟草病原菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增,结果表明:只有T. basicola能扩增到一条400bp左右的特异性条带,其它菌株及阴性对照均无扩增产物。对烟草组织和土壤的检测结果也表明,该对引物能特异性的检测到T. basicola基因组DNA的存在。该引物对T. basicola基因组DNA检测的灵敏度为100fg/μL。     

柑橘黄龙病菌效应蛋白与寄主互作研究进展与展望

柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing, HLB)是柑橘生产上的毁灭性病害, 其病原是韧皮部杆菌属的革兰氏阴性难养细菌, 我国发生的黄龙病病原为韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’, CLas)。由于黄龙病菌未能实现纯培养, 难以进行传统的分子和遗传操作, 导致其致病机理研究滞后。近年来, 有关黄龙病菌效应蛋白的筛选鉴定及其与寄主靶标互作机制成为研究热点。本文重点介绍了黄龙病菌分泌系统特征、效应蛋白与寄主互作机制及抗病种质创制, 展望了该领域未来的研究方向。     

西双版纳自然保护区球孢白僵菌的遗传多样性

为了解西双版纳自然保护区球孢白僵菌Beauveria bassiana的遗传多样性,采用SSR分子标记技术对西双版纳自然保护区的240株球孢白僵菌的遗传结构、基因流、菌株分化以及遗传变异相关性进行了测定和分析。结果表明,9条引物扩增240株球孢白僵菌菌株多态位点数为77个,多态位点比率为97.40%。采集的240株球孢白僵菌的总体等位基因数、有效等位基因数、Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为1.97、1.31、0.18和0.29。从寄主居群来看,鞘翅目昆虫球孢白僵菌群体遗传多样性最高,螳螂目最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为0.20和0.30、0和0;总遗传变异的29.27%存在于寄主居群间。从生境水平来看,五十五生境中球孢白僵菌群体遗传多样性最高,丫口寨生境中最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数最高分别为0.19和0.31、0.06和0.09;总遗传变异的14.92%存在于生境居群间。从季节水平来看,球孢白僵菌秋季居群的遗传多样性最高,夏季最低,其Nei’s基因多样性指数和Shannon信息多样性指数分别为0.20和0.32、0.17和0.26;总遗传变异的3.45%存在于季节居群间。表明西双版纳自然保护区球孢白僵菌在寄主昆虫、生境分布和季节间存在明显的遗传多样性,与寄主昆虫类群的关系密切。     

不同栽培模式下葡萄霜霉病菌遗传结构的时间动态分析

为明确不同栽培模式下葡萄霜霉病菌Plasmopara viticola的遗传结构、遗传多样性及遗传分化水平,于2014-2015年定期采集露地和避雨2种栽培模式下的葡萄霜霉病菌菌株,利用6对SSR引物对该病菌基因型、遗传多样性及遗传分化进行对比分析。结果表明,露地和避雨栽培模式下葡萄霜霉病菌群体的Nei’s基因多样性指数大于0.14,香农多样性指数大于0.31,2种栽培模式下群体具有丰富的遗传多样性,但避雨栽培模式可显著降低群体等位基因数和等位基因频率。露地栽培模式下该病菌群体的流行模式呈现中等水平无性繁殖,2年初侵染和再侵染对病害流行的贡献率分别约占26.1%和73.9%;避雨栽培模式下葡萄霜霉病菌群体的流行模式则呈现高等水平无性繁殖,初侵染和再侵染对病害流行的贡献率分别约占4.3%和95.7%。卵孢子的形成对于葡萄霜霉病菌种群遗传变异和有效越冬起着关键的作用。2014-2015年露地栽培模式下葡萄霜霉病菌群体的主效流行基因型对病害流行的贡献率分别为44.5%和51.8%;而其在避雨栽培模式下葡萄霜霉病菌群体的贡献率分别可达84.2%和87.1%。同一年份的露地和避雨栽培模式下葡萄霜霉病菌群体的主效基因型种类相同,2个群体间的等位基因频率呈现显著正相关性,且二者之间存在频繁的基因交流,推测避雨栽培模式下葡萄霜霉病的初侵染源自于避雨设施附近的露地栽培病株上再侵染形成的飞散传播孢子囊。     

基于全基因组重测序的中国猕猴桃溃疡病菌遗传多样性分析

 由Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是为害猕猴桃的一种毁灭性病害,1996年被列为我国森林植物检疫对象。本研究对来源于我国7个受溃疡病为害最严重地区的21个Psa菌株进行重测序分析,通过主成分分析和系统发育学分析将21个菌株分为三大类群;固定系数分析结果显示所有群体的F_ST值均小于0.05;核苷酸多态性分析结果显示所有菌株的Θπ值仅为3.74×10^-6,且各群体间的差异不明显。这些结果表明Psa在我国的遗传多样性处于低水平状态。基因流(Nm)分析结果显示不同群体之间的Nm值均大于4,表明各群体病原菌之间存在较大的基因交流;Tajima′s D中性检验结果显示所有群体的Tajima′s D值均大于0,暗示各群体都经历平衡选择;Ka/Ks分析结果显示Psa的大部分基因都受到纯化选择,仅有极少数的基因受到正选择。本研究揭示了中国7个受溃疡病危害最严重地区Psa的遗传多样性,并且获得大量基因组数据,可为病害防治、病原菌耐药性以及抗病植株的选育提供理论依据。     

中国4省猕猴桃细菌性溃疡病菌的生物型检测和遗传多样性分析

由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)侵染引起的猕猴桃细菌性溃疡病(kiwifruit bacterial canker)是全球猕猴桃生产上最具毁灭性的细菌病害。为探明福建、安徽、四川和陕西4省Psa菌株的生物型和遗传多样性,用5对PCR特异性引物PsaJ-F/-R、PsaK-F/-R、Tac-F/-R、Con002-F/-R和avrRps4-F1/-R2检测Psa菌株的生物型;用4对PCR引物27F/1492R、PsaF1/PsaR2、gapA-Fps/Rps和rpoD+364s/-1222ps分别扩增16S rRNA、ITS、gapA和rpoD基因,进行多基因联合分析Psa菌株的遗传多样性。结果表明,特异性引物Tac-F/-R从47株Psa菌株中均能扩增出一条545 bp的特异条带,其他4对引物未扩增出任何条带,说明供试Psa菌株的生物型均为biovar 3。多基因联合分析表明,4省Psa存在丰富的遗传多样性,4个群体共检测出27个单倍型,单倍型多样性为0.955。安徽、福建、四川和陕西群体的单倍型数差异较大,分别为1、8、12个和12个。4个群体的多态性位点数、核苷酸多样性和平均核苷酸差异数差异极显著(P<0.01),其中福建群体的多态性最丰富,而安徽群体的多态性最低。AMOVA分析表明,3.6%的遗传变异来源于种群间,而96.4%的遗传变异来源于种群内,说明种群内变异是遗传变异的主要来源。遗传分化分析表明,安徽省Psa群体与其他3个群体间的遗传分化极高(Fst>0.175),福建、四川和陕西群体间的遗传分化水平较低(Fst<0.017)。研究结果有利于了解福建省Psa的来源,为阻断Psa的传播和猕猴桃细菌性溃疡病的长期可持续控制提供了理论参考。     

基于全基因组重测序的中国猕猴桃溃疡病菌遗传多样性分析

 由Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是为害猕猴桃的一种毁灭性病害,1996年被列为我国森林植物检疫对象。本研究对来源于我国7个受溃疡病为害最严重地区的21个Psa菌株进行重测序分析,通过主成分分析和系统发育学分析将21个菌株分为三大类群;固定系数分析结果显示所有群体的F_ST值均小于0.05;核苷酸多态性分析结果显示所有菌株的Θπ值仅为3.74×10^-6,且各群体间的差异不明显。这些结果表明Psa在我国的遗传多样性处于低水平状态。基因流(Nm)分析结果显示不同群体之间的Nm值均大于4,表明各群体病原菌之间存在较大的基因交流;Tajima′s D中性检验结果显示所有群体的Tajima′s D值均大于0,暗示各群体都经历平衡选择;Ka/Ks分析结果显示Psa的大部分基因都受到纯化选择,仅有极少数的基因受到正选择。本研究揭示了中国7个受溃疡病危害最严重地区Psa的遗传多样性,并且获得大量基因组数据,可为病害防治、病原菌耐药性以及抗病植株的选育提供理论依据。