17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2(SBD-2)表达的可能信号通路研究

【目的】探讨17β-雌二醇(E2)上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2表达的可能信号通路。【方法】分离培养绵羊输卵管上皮细胞,将第2代输卵管上皮细胞分为E2(10-8 mol/L)组、雌激素受体拮抗剂ICI182780(10-7mol/L)组、PKA阻断剂KT-5720(1μmol/L)组、PKC阻断剂H-7(50μmol/L)组、NF-κB阻断剂PDTC(50μmol/L)组及空白对照(Control)组,在不同阻断剂组加入各自阻断剂干预绵羊输卵管上皮细胞1h后,在各阻断剂组和E2组中再加入10-8 mol/L 17β-雌二醇培养6h,然后采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组SBD-2mRNA表达水平的变化。【结果】10-8 mol/L 17β-雌二醇可显著上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2mRNA的表达(P<0.05);雌激素受体拮抗剂ICI182780、NF-κΒ阻断剂PDTC、PKC阻断剂H-7均可阻断17β-雌二醇对SBD-2的上调作用,PKA阻断剂KT-5720对17β-雌二醇介导的SBD-2上调无明显影响。【结论】17β-雌二醇上调绵羊输卵管上皮细胞SBD-2的表达由雌激素核受体、NF-κΒ、PKC信号转导通路所介导,而PKA不参与17β-雌二醇对SBD-2的上调作用。     

酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)基因表达的影响

【目的】探索益生性酿酒酵母菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的调节作用,为在分子水平上揭示益生菌对防御素的调控机理提供一定的理论基础及依据。【方法】首先将新鲜的绵羊瘤胃组织用PBS和抗生素处理后进行瘤胃上皮细胞原代培养,当原代细胞数量长到细胞培养瓶的85%以上时,将细胞传于12孔板用于细胞刺激试验。同时将活化并纯化后的酿酒酵母菌25℃、180 r/min有氧培养48 h后,进行5次平行平板计数试验,根据平板计数的数据处理方法,得到浓度为5.2×108CFU·m L-1的酿酒酵母菌液,再通过倍比稀释把所得菌液依次稀释成浓度为5.2×107、5.2×106、5.2×105、5.2×104CFU·m L-1的菌液,用以上不同浓度(5.2×104—5.2×108CFU·m L-1)的酿酒酵母菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞分别进行不同时间(2、4、8、12、24 h)的刺激,并设置对照组用DMEM/F12培养基代替酿酒酵母菌。然后提取总RNA,逆转录为c DNA后,利用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测瘤胃上皮细胞中SBD-1表达差异。最后用SAS 9.2软件对数据进行相关差异性分析。【结果】荧光定量PCR结果表明,在各时间组内SBD-1 m RNA的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势,当菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1时表达量达到最大,并与对照组和其他浓度组相比差异极显著(P0.01)。当菌液浓度一定时,SBD-1 m RNA的表达量先是随着刺激时间的延长而呈上升趋势,刺激时间为12 h时SBD-1 m RNA表达量达到峰值,之后呈下降趋势。因此,当浓度为5.2×107CFU·m L-1的菌液刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1基因的表达量达到最高,且与此浓度下其他时间组的表达量相比差异极显著(P0.01)。ELISA检测结果显示,SBD-1蛋白表达趋势与SBD-1 m RNA检测结果基本一致。不同浓度的菌液分别刺激绵羊瘤胃上皮细胞2、4、8、12、24 h后均能提高共培养上清中SBD-1蛋白的表达,且与对照组相比存在极显著差异(P0.01)。在菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高,与此浓度下各时间组相比差异极显著(P0.01)。【结论】酿酒酵母菌能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·m L-1刺激瘤胃上皮细胞12 h后,SBD-1的表达量达到最高。     

17β-雌二醇对体外培养牛输卵上皮细胞中环氧合酶-2的表达影响

目的:阐明17β--雌二醇(17β-estradiol,E2)对体外培养的奶牛输卵管上皮细胞(bovine oviduct epithelialcells,BOECs)中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)基因表达的影响.方法:分离培养BOECs,建立BOECs培养体系作为体外试验模型,分别在培养液中添加10 pg/mL的E2分别培养2h、4h、6h,提取细胞总RNA及细胞总蛋白,利用实时荧光定量PCR,Western blot等实验技术检测COX-2mRNA和蛋白的表达量.结果:输卵管上皮细胞的COX-2基因表达随添加E2培养液增加2h、4h明显高于对照组.结论:试验数据显示在体外培养的BOECs中E2影响牛输卵上皮细胞中COX-2的表达.     

热应激对黄体孕酮代谢通路的影响

[目的]以假孕大鼠为模型,探讨热应激对氯前列烯醇(PGF)诱导的黄体退化过程中孕酮水平及其代谢通路相关蛋白表达的影响。[方法]用PMSG/h CG(D0)联合处理50只大鼠,诱导假孕,然后随机分为非热应激(NHS)和热应激(HS)两组。每天在相同时间,将HS组置于40℃应激2 h。假孕第7天,热应激结束2 h后,各组大鼠以PGF分别处理0、1、2、8和24 h后屠宰,收集血清和卵巢组织。用酶联免疫法检测血清孕酮浓度,蛋白免疫印迹法和免疫组织化学法检测孕酮水平及其代谢通路相关蛋白的表达。[结果]热应激前、后假孕大鼠的直肠温度差异显著(P0.05);PGF降低了两组大鼠血清孕酮浓度,热应激抑制了PGF诱导的孕酮浓度下降(P0.05);PGF或热应激处理对PKA磷酸化底物、St AR、P450scc、3βHSD及NR4A1-F表达均无显著影响(P0.05),但均诱导NR4A1-S表达上调(P0.05),且热应激降低PGF诱导的NR4A1-S表达(P0.05);PKA磷酸化底物主要在类固醇生成细胞的细胞核中表达,而St AR、P450scc、3βHSD和NR4A1-F均在类固醇生成细胞的细胞质表达。[结论]热应激降低了PGF诱导的假孕大鼠黄体退化过程中NR4A1-S的表达,提示NR4A1-S可能参与调控黄体退化过程中孕酮的代谢。     

FSH和17β-雌二醇联合作用对仔猪睾丸 支持细胞Skp2表达的调节

 【目的】确定FSH和雌激素联合作用是否可通过ERK1/2级联调节培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中Skp2的表达。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用Western blotting和实时荧光定量PCR检测Skp2蛋白、mRNA的表达。【结果】FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用时以时间依赖的方式促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,这一作用在30 min时到达高峰;FSH（50 ng·mL-1）、17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）和forskolin单独作用均促进了Skp2蛋白和mRNA的表达（P＜0.05）,FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2表达的影响与FSH或17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）单独作用无显著差异（P≥0.05）,而环磷酸腺苷抑制剂（Rp-cAMP）、蛋白激酶A（PKA）抑制剂（H-89）、L-Ca2+离子通道抑制剂（verapamil）和ERK1/2抑制剂（U0126）单独作用时对Skp2蛋白和mRNA的表达与空白对照相比无显著影响（P＞0.05）,但都抑制了FSH（50 ng·mL-1）与17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对Skp2蛋白和mRNA表达的影响（P＜0.05）。H-89、verapamil单独作用对ERK1/2（细胞外信号调节的蛋白激酶1/2）活性没有影响,但降低了FSH（50 ng·mL-1）和17β-雌二醇（10-9 mol·L-1）联合作用对ERK1/2活性的影响。【结论】 FSH与17β-雌二醇联合作用激活了cAMP-PKA级联和Ca2+内流,而PKA和Ca2+内流又通过影响ERK1/2的活性进而影响Skp2的表达。     

利用Onapristone研究绵羊子宫内膜组织中孕酮对PGF2α分泌以及COX-2表达的影响

为了探讨孕酮通过环氧合酶-2(COX-2)/前列腺素2α(PGF2α)信号通路调节家畜黄体溶解的作用机制,本研究采用孕酮受体的特异抑制剂Onapristone处理体外培养的绵羊子宫内膜组织,检测分泌到培养液中的PGF2α浓度以及子宫内膜中PGF2α合成过程中关键酶基因COX-2的mRNA和蛋白质表达水平。结果显示,Onapristone添加到子宫内膜组织培养液中后,内膜组织合成分泌的PGF2α浓度明显下降,且抑制了COX-2 mRNA和蛋白质表达水平,高剂量的Onapristone(20.0μmol/L)处理72 h后COX-2的蛋白表达水平仅为对照组的23%。表明,孕酮通过其受体介导的COX-2/PGF2α信号通路调节家畜的黄体溶解过程,且COX-2对于PGF2α的合成起到重要的作用。     

IFN-γ对奶牛乳腺上皮细胞转分化的影响

[目的]用转化生长因子-β_1(TGF-β_1)诱导奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),以不同浓度的IFN-γ为阻断剂,探讨干扰素-γ(IFN-γ)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)表型重塑的作用。[方法]将原代培养的BMEC分为对照组、诱导组(TGF-β_110ng/m L)、药物组(IFN-γ20 ng/m L)及阻断组(TGF-β_110 ng/m L+IFN-γ10、20、50、100 ng/m L)。培养72 h后,观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、结缔组织生长因子(CTGF)和胶原Ⅰ(COLⅠα1)的mRNA相对表达量。[结果]诱导组α-SMA、CTGF和胶原Ⅰ mRNA相对表达量显著增加(P0.05);药物组CTGF的mRNA相对表达量与对照组相比无显著差异(P0.05),α-SMA和COLⅠα1mRNA相对表达量显著下降(P0.05);阻断组IFN-γ明显抑制了TGF-βl诱导的转分化。[结论]IFN-γ能够负性调控TGF-β_1诱导的奶牛乳腺上皮细胞-肌纤维母细胞转分化(EMT),减少COLⅠα1分泌。     

雌二醇和孕酮对小鼠子宫半胱亚磺酸脱羧酶基因表达和牛磺酸含量的调控

实验主要研究了17β-雌二醇(E2)和孕酮(P4)对小鼠子宫组织中半胱亚磺酸脱羧酶基因(CSD)表达和牛磺酸含量的调控。给去卵巢小鼠分别皮下注射植物油(对照组)、17β-雌二醇(E2)、孕酮(P4)、E2和P4、E2和氟维司群(ICI 182780)、P4和米非司酮(RU486),24h后观察各组小鼠子宫中CSD的表达和牛磺酸的含量。Real-time PCR和Western blot定量分析结果显示,每只小鼠注射1μg E2能够显著抑制CSD的mRNA和蛋白的表达,6mg P4能够显著促进CSD mRNA和蛋白的表达,其受体抑制剂RU486和ICI182780都能逆转它们的作用。高效液相色谱(HPLC)测定结果显示,注射1μg E2和6mg P4分别下调和上调子宫组织中牛磺酸的含量。上述结果提示E2和P4可能通过受体途径参与调节子宫CSD的表达,从而调节子宫中牛磺酸含量。     

Ghrelin对绵羊早期体外胚胎发育调节机制的初步研究

【目的】探讨Ghrelin对绵羊早期胚胎发育的调节机制。【方法】将绵羊体外受精早期胚胎在Ghrelin组(300,1 000,10 000ng/mL)、Ghrelin受体拮抗剂D-Lys3-GHRP-6组(10,200,400ng/mL)、D-Lys3-GHRP-6+Ghrelin组(D-Lys3-GHRP-6 400ng/mL,Ghrelin 300,1 000和2 000ng/mL)、空白对照(不加D-Lys3-GHRP-6和Ghrelin)4个组别的胚胎发育液中进行发育培养,采用荧光定量PCR技术分别对各处理不同发育阶段(2-细胞期、4-细胞期、8-细胞期和16-细胞期)绵羊早期胚胎中ERK1、ERK2、P90rsk、Bcl-2、Bax mRNA的表达情况进行检测。【结果】与空白对照组相比,在添加Ghrelin组ERK1、ERK2、P90rsk、Bcl-2基因mRNA的表达表现为显著性上调(P0.05),且这种上调作用可被D-Lys3-GHRP-6所拮抗;在添加Ghrelin组Bax基因mRNA的表达无显著性变化,但在D-Lys3-GHRP-6组Bax基因mRNA的表达表现为显著性上调(P0.05)。【结论】Ghrelin可级联激活MAPK信号通路,抑制促凋亡基因Bax的表达、促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,进而促进绵羊早期胚胎的发育。     

雌激素对GT1-7细胞GnRH分泌及相关基因表达的影响

【目的】研究低浓度雌激素对下丘脑GnRH分泌以及ERα、GnRH等6个生殖相关基因表达的影响.【方法】采用体外培养GT1-7细胞,对照组添加溶剂(无水乙醇),试验组添加雌激素(100pmol/L),培养1、3、6、12、18、24、30、36h收集细胞和培养上清液,利用酶联免疫法(ELISA)测定收集上清液中GnRH浓度,并利用相对荧光定量法测定目的基因的表达.【结果】与对照组相比,试验组GnRH分泌呈增加趋势,培养12h左右GnRH分泌达到峰值(P0.05);ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54mRNA相对表达量先增加后降低,4种基因mRNA依次在18h(P0.01)和24h(P0.05)、6h(P0.01)、3h(P0.01)、6h和12h(P0.05)表达显著增加.nNOS和c-fos mRNA相对表达量较对照组呈降低趋势,这2种基因mRNA依次在30h和36h(P0.05)、3h(P0.01)表达显著降低.【结论】100pmol/L雌激素能够促进GT1-7细胞分泌GnRH,这种作用可能是通过调控ERα、GnRH、Kiss-1、GPR54、nNOS以及c-fos mRNA的表达实现的.     

赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞中酪蛋白及mTOR信号通路相关基因表达的影响

为了在探究单一添加不同浓度的赖氨酸对原代奶牛乳腺上皮细胞的增殖,以及mTOR信号通路介导的酪蛋白合成相关基因的影响.试验用厄尔平衡溶液(EBSS)代替正常培养基来处理原代奶牛乳腺上皮细胞,在此基础上依次添加不同浓度的赖氨酸,采用MTT法检测细胞12h和24h的增殖和利用qRT-PCR技术检测4个编码酪蛋白基因和8个mTOR信号通路中与乳蛋白合成翻译相关基因的相对表达量.结果表明:添加赖氨酸12h,浓度为0.5~24mmol/L时,原代奶牛乳腺上皮细胞增殖数量增加(P=0.05);添加赖氨酸24h,浓度为0.5~8mmol/L时,细胞增殖数量增加(P0.01).当赖氨酸的添加浓度为0.5~16 mmol/L时,CSN1S1、CSN1S2、CSN2和CSN3基因表达均显著上调(P0.01).当赖氨酸添加量为0.5~16mmol/L时,mTOR和raptor基因的表达量显著上调(P0.05).在添加不同浓度的赖氨酸时,下游通路信号因子S6K1、4EBP1和eEF2基因表达均显著上调(P0.01);rps6基因表达上调,eIF4E基因表达下调,但差异均不显著.以上结果表明,补充赖氨酸能显著促进乳腺上皮细胞中酪蛋白的合成,这一过程与mTOR信号通路介导蛋白质合成相关.     

SCFAs对奶牛瘤胃上皮细胞Ca2+信号通路相关基因表达的影响

为探究短链脂肪酸(SCFAs)对奶牛瘤胃上皮细胞(BRECs)Ca~(2+)信号通路相关基因表达的影响,试验分为3个处理组,分别为野生型BRECs组,含20mmol/L SCFAs BRECs组,含20mmol/L SCFAs且通过CRISPR/Cas 9系统敲除GPR41基因的BRECs组,每个处理组3个重复,每组细胞均培养24h后,收集细胞提取总RNA,通过qRT-PCR对Ca~(2+)信号通路相关基因的mRNA表达量和细胞内Ca~(2+)浓度进行测定。结果表明,与野生型BRECs相比,添加20mmol/L SCFAs可极显著增加PLCB2的mRNA表达量(P0.01),显著增加IP3R1的mRNA表达量(P0.05),对PLCE1、PLCL1、PKCB和PKCG的mRNA表达量无显著差异(P0.05),可增加细胞内Ca~(2+)浓度但无显著差异(P0.05);敲除SCFAs的受体GPR41后,添加20 mmol/L SCFAs可显著降低IP3R1的mRNA表达量(P0.05),极显著上调PLCE1和PLCB2的mRNA表达量(P0.01),但对PLCL1、PKCB和PKCG的mRNA表达量无显著影响(P0.05),细胞内Ca~(2+)浓度有降低趋势但无显著差异(P0.05)。综上,SCFAs可以通过激活其受体GPR41来调控BRECs内Ca~(2+)信号通路中相关基因的表达和细胞内Ca~(2+)的释放。     

4-硝基苯酚对大鼠肾上腺皮质孕酮分泌的影响

[目的]设计体内体外试验研究环境内分泌干扰物4-硝基苯酚(4-nitrophenol,PNP)对雄性大鼠肾上腺皮质孕酮分泌的影响.[方法]体内试验采用24只SPF级雄性未成年SD大鼠,随机分为4组,连续2周皮下注射(剂量为0、0.1、1.0和10.0 mg·kg-1的PNP).最后一次注射24 h后称体质量,然后麻醉处死,收集血液及各脏器,以备测定;为进一步确定PNP对肾上腺皮质孕酮分泌的影响,体外试验利用肾上腺皮质细胞原代培养,细胞贴壁后用不同浓度的PNP(0、101、10-5和10-4 mol· L-1)培养24h.[结果]体内试验结果显示:0.1和1.0 mg·kg-1 PNP处理组大鼠脾脏质量显著低于对照组(P＜0.05),但是体质量及其他脏器质量和脏器指数均无显著性差异(P＞0.05);10.0 mg·kg-1组大鼠血清睾酮水平显著升高(P＜0.05),而孕酮水平显著降低(P＜0.05),雌二醇水平差异不显著(P＞0.05);光学显微镜组织学检查未发现注射PNP组肾上腺皮质形态异常,但RT-PCR结果显示10.0 mg·kg-1 PNP处理大鼠肾上腺中StAR、P450scc和P450c17 mRNA表达显著增加(P＜0.05),而3β-HSD mRNA表达显著降低(P＜0.05).体外试验结果显示:与对照组相比,注射PNP组培养液中孕酮水平显著降低(P＜0.05).[结论]4-硝基苯酚可能主要通过影响肾上腺类固醇合成酶的表达来影响肾上腺皮质孕酮的分泌功能.     

慢性缺氧对小鼠成纤维细胞氨基酸代谢通路基因表达的影响

目的 观察低氧诱导小鼠成纤维细胞L929中氨基酸代谢相关基因mRNA表达变化.方法 L929细胞分别在20％ O2和1％ O2环境中培养24 h,提取总RNA,Agilent mRNA芯片检测基因表达,分析与氨基酸代谢相关的差异表达基因及其信号通路.结果 低氧诱导24 h后,17个氨基酸代谢相关基因出现2.18～6.34倍差异表达(Ddc、Ogdh、Wars2、Il4i1、Haao、Ogdhl、Ehhadh、Cyp1a1、Gls2、Adc、Nos2、Nos3、Dao、Gls、P4ha1、P4ha2、Pycr1),其中14个表达上调,3个表达下降.富集分析表明差异基因聚集在色氨酸(P=0.0 195)、精氨酸和脯氨酸代谢通路(P=0.0297).结论 低氧可诱导小鼠L929细胞发生氨基酸代谢相关基因差异表达,其中色氨酸、精氨酸和脯氨酸代谢通路基因变化最显著.     

Notch信号通路在血管紧张素-Ⅱ诱导炎症反应中的作用

目的 探讨Notch信号通路在血管紧张素-Ⅱ(AngⅡ)诱导炎症反应中的作用.方法 THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞,给予Ang Ⅱ处理,用qRT-PCR和免疫印迹检测Notch1、Dll1、TLR-4、NFκB及炎性因子表达.采用siRNA沉默TLR-4或SN50阻断NFκB,观察炎性因子变化.结果 巨噬细胞中Notch1、Dll1蛋白表达在Ang Ⅱ处理后呈时间依赖性增加(P＜0.05).TLR-4、NFκB、IL-1β和TNF-α表达在Ang Ⅱ处理24h后明显升高(P＜0.05),而IL-6表达明显降低(P＜ 0.05);TLR4沉默或NFκB阻断后,IL-1β、IL-6和TNF-α表达无明显变化.结论 Notch信号通路在Ang Ⅱ诱导炎症反应中具有重要作用,针对Notch信号通路的调节可能有助于改善动脉粥样硬化.     

漏芦对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因表达的影响

为探讨漏芦对泌乳动物乳腺酪蛋白合成的调节机制,利用细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(25、50、100、200、400、600、800μg/mL)对奶山羊乳腺上皮细胞活力和增殖能力的影响,并选择不抑制细胞生长增殖的乙醇提取物剂量,研究其对奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因mRNA表达的影响;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测乳腺上皮细胞αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白(CSN1S2)、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白(CSN3)、信号转导与转录激活因子5(STAT5)、蛋白质酪氨酸激酶2(JAK2)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)、真核细胞翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)及核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)基因的mRNA表达水平。结果表明,较高剂量(200～800μg/mL)的漏芦乙醇提取物明显抑制了奶山羊乳腺上皮细胞的活力和增殖能力(P0.05),故后续试验添加25、50、100μg/mL的漏芦乙醇提取物处理乳腺上皮细胞;漏芦乙醇提取物可明显上调细胞酪蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3及酪蛋白合成相关基因STAT5、JAK2、mTOR、S6K1的mRNA表达水平(P0.05),但显著下调了4EBP1基因的mRNA表达水平(P0.05)。由此可见,漏芦乙醇提取物能通过调节奶山羊乳腺上皮细胞酪蛋白合成相关基因的表达,进而促进乳腺细胞酪蛋白的合成。     

丙酸对山羊小肠上皮细胞糖异生途径关键基因表达的影响

为探究丙酸对山羊小肠上皮细胞(GIEC)糖异生途径关键基因表达是否有影响,试验分为2个部分:第1部分分为4个处理组,分别添加0、0.75、1.50和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,6h后收集细胞提取总RNA;第2个部分分为2个处理组,分别添加0和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,培养3、6、12和24h时,收集细胞提取总RNA。通过qRT-PCR对糖异生途径关键基因的mRNA表达量进行测定。结果表明,0.75和1.50mmol/L丙酸对PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达量无显著影响(P0.05);1.50mmol/L丙酸可显著增加PCK2的mRNA表达量(P0.05);3.00mmol/L丙酸可显著增加PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.05),还可上调PC和FBP1 mRNA表达量但无差异(P0.05)。与未处理组相比,3.00mmol/L丙酸在6h时可极显著上调PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.01),还可增加PC和FBP1的mRNA表达量(P0.05);在12～24h对糖异生途径关键基因没有影响(P0.05)。综上,丙酸可以在山羊小肠细胞中诱导糖异生途径关键基因PCK2、PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达,并且PCK2在山羊小肠上皮细胞糖异生途径中发挥关键作用。     

FSH激活的ERK1/2信号通路在GC细胞增殖分化过程中的作用

为探明由促卵泡刺激素(FSH)激活的胞外信号调节蛋白激酶1/2 (ERKl/2)通路在颗粒细胞(GC)增殖分化过程中的作用,以分离培养的SD大鼠GC为材料,研究了FSH激活的ERK1/2通路对GC增殖和分化的影响.结果显示:FSH快速诱导了ERK1/2的磷酸化,这种诱导作用具有时间依赖性,FSH作用0.33h时其磷酸化水平达到最高,用磷酸蛋白激酶A(PKA)的特异性抑制剂H89抑制PKA活性,显著降低了FSH和腺苷酸环化酶激活剂(forskolin)对ERK1/2的激活作用.以增殖细胞核抗原(PCNA)为GC增殖指标,以甾体生成快速调节蛋白(StAR)和甾体生成为GC分化指标,检测发现50 ng/mL的FSH以时间依赖方式诱导了PCNA蛋白的表达,FSH处理2h,PCNA蛋白水平达到最高;用UO126(ERK1/2的特异性抑制剂)阻断ERK1/2通路发现,FSH对PCNA和甾体生成的促进作用明显减弱;激光共聚焦检测结果进一步显示,与对照组相比,FSH组StAR信号明显增强,抑制ERK1/2活性显著降低了StAR的荧光强度.可见,FSH激活的ERK1/2通路促进了PCNA和甾体的生成,诱导了GC的增殖和分化.     

绵羊甲状腺miR-370-3p靶向COL4A3基因调控繁殖力性状的初步研究

为探讨小尾寒羊甲状腺组织中与繁殖功能相关的miR-370-3p与COL4A3的靶向关系,本研究利用miRDB与Targetscan网站预测了miR-370-3p的靶基因,并取其交集进行功能富集分析,通过RNAhybrid与Targetscan网站预测绵羊miR-370-3p与候选靶基因的结合位点;随后检测了miR-370-3p与COL4A3基因在小尾寒羊甲状腺组织中的相对表达量。构建psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型/突变型双荧光素酶载体,并将其与miR-370-3p mimics/mimics NC共转染至HEK293T细胞并检测荧光活性。结果显示：1)miR-370-3p的靶基因可富集到孕酮介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、mTOR信号通路、Ras信号通路和FoxO信号通路等与动物繁殖有关的信号通路中。2)miR-370-3p可与COL4A3基因3′UTR区域结合,且两者在小尾寒羊甲状腺组织中表达呈相反趋势。3)共转染psiCHECK2-COL4A3-3′UTR-野生型和miR-370-3p mimics组的荧光素酶活性显...     

NF-κB信号通路在丝状支原体山羊亚种感染中的作用

为分析细胞核转录因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路在丝状支原体山羊亚种(Mmc)感染山羊肺泡上皮细胞中的分子作用机制,将Mmc感染细胞,于4 h、8 h、12 h和24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测NF-κBp65 mRNA的表达水平。采用不同浓度的NF-κB抑制剂BAY11-7082与细胞孵育1 h,然后用Mmc感染细胞,于24 h收集细胞,利用实时定量PCR检测白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达水平,用试剂盒检测Caspase-3活性、H2O2和NO浓度变化,利用平板计数检测Mmc对细胞的致病力变化。结果显示,Mmc于8 h、12 h和24 h等3个时间点显著提高细胞NF-κBp65 mRNA表达水平(P0.01);Mmc显著提高细胞IL-8 mRNA水平、TNF-αmRNA水平、Caspase-3的活性、H2O2和NO浓度(P0.01),而BAY11-7082(浓度为5μmol/L和10μmol/L)能够显著降低Mmc介导的细胞IL-8 mRNA水平、TNF-αmRNA水平、Caspase-3的活性、H2O2和NO浓度的升高(P0.05),且可显著降低细胞中Mmc存活量(P0.05)。综上可知,NF-κB信号通路在Mmc致病机制中发挥重要作用。