梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21（DE3）pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。     

Notch信号通路在体外培养的鹿茸干细胞中的表达

Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统,在调节干细胞增殖、分化和凋亡方面起到重要作用。研究表明,鹿生茸区骨膜和角柄骨膜分别含有鹿茸发生和再生的干细胞。应用RT-PCR的方法对离体培养生茸区骨膜和角柄骨膜细胞进行检测,得出Notch信号通路各信号因子在2种细胞中的表达情况。结果:Notch-1、Notch-2、Notch-4、Dll-4J、agged-1J、agged-2、Hes-1等信号因子在这2种干细胞中均有不同程度的表达,说明Notch信号通路可能参与了他们的增殖、分化的调控。     

鹿茸干细胞p21基因表达水平及其对细胞周期的影响

为初步探讨p21基因在基于鹿茸干细胞的鹿茸再生过程中所起的生物学作用,本研究利用qRT-PCR以及流式细胞术,以鹿脸部骨膜细胞(FPCs)为对照组,对鹿茸干细胞的生茸区骨膜细胞(APCs)和角柄骨膜细胞(PPCs)中p21基因mRNA表达水平和细胞周期分布进行了检测。进一步通过RNAi干扰技术,抑制APCs中p21基因表达水平,验证其对细胞周期分布的影响。结果表明,鹿茸干细胞中p21基因mRNA表达水平显著高于对照组细胞(APCs PPCs FPCs,P 0.05);相对于对照组细胞,鹿茸干细胞周期分布没有显著差异;低表达p21基因的APCs细胞周期无显著变化,说明p21基因表达水平的变化对鹿茸干细胞周期无直接影响。本研究为深入揭示该基因在鹿茸干细胞中高表达所起的生物学作用奠定了基础。     

鹿生茸区骨膜不同部位生茸潜力的研究进展

鹿茸是雄鹿的第二性征,是由雄鹿头部额外脊处的骨膜组织所形成的,这部分骨膜被称为"生茸区骨膜"。生茸区骨膜具有巨大的生茸潜力,将生茸骨区膜移植到鹿体的其它部位,能诱导异位鹿茸的发生;一片直径约2cm的生茸区骨膜组能够在约60d的内再生出约10kg左右的鹿茸组织。研究发现,生茸区骨膜不同区域具有不同的生茸潜力,分别负责形成鹿茸的不同分枝和主干;生茸区骨膜细胞为干细胞。鹿茸干细胞的发现,为研究鹿茸生物学特性和揭示鹿茸完全再生机制开辟了一条新的通路。     

鹿茸发生和再生的组织基础及其研究进展

通过对鹿茸生长发育机理研究的整理和总结,阐述了鹿茸发生和再生过程中的组织变化,特别是关于生茸区骨膜和角柄骨膜的研究,取得了重要的成果．生茸区骨膜切除后不能发生角柄和鹿茸,而被移植了生茸区骨膜的位置则生长角柄和鹿茸,证明了生茸区骨膜是鹿茸发生的组织基础,确定了生茸区骨膜中存在鹿茸再生干细胞,为进一步研究鹿茸的生长发育机理提供了重要的依据和参考．     

鹿茸间充质干细胞条件培养基对乳腺癌细胞系4T1的作用

本试验主要探讨了鹿茸间充质干细胞条件培养基对乳腺癌细胞4T1的作用。分离、培养、鉴定了鹿茸间充质干细胞,采用MTT法检测了鹿茸间充质干细胞条件培养基对4T1细胞的增殖活性的影响,并通过Western blot检测了对4T1细胞凋亡的影响。结果显示,鹿茸间充质干细胞条件培养基可抑制4T1细胞的增殖,并呈浓度依赖性,并伴有4T1细胞内Cleaved-caspase 3蛋白表达上调以及Bcl-xl蛋白表达的下调。这一结果表明,鹿茸间充质干细胞条件培养基可抑制4T1细胞增殖,其机制与细胞内凋亡信号通路有关。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

Galectin-1促进再生及在鹿茸再生中的免疫调节作用

鹿茸再生是基于鹿茸干细胞的发育过程。研究发现,半乳糖凝集素1(Galectin-1)在鹿茸干细胞中差异表达,具有免疫抑制功能。本文综述了Galectin-1在鹿茸再生中的免疫调控作用,为揭示鹿茸再生的免疫调控机制提供了重要理论依据,为再生医学模型的建立奠定了基础。     

梅花鹿鹿茸细胞端粒酶活性及其mRNA表达的检测

[目的]研究鹿茸生长期端粒酶的表达,为揭示鹿茸生长发育的调控机制提供了新思路。[方法]在鹿茸快速生长阶段,采用改进的TRAP（端粒重复序列扩增技术）法检测鹿茸顶端增殖区的间充质层、前软骨层和软骨层细胞及下端成熟区的端粒酶活性。同时,采用RT-PCR的方法检测各组织细胞中端粒酶催化亚基（TERT）mRNA的表达水平。[结果]在顶端增生区各组织细胞中均检测到了不同程度的端粒酶活性,间质细胞、前软骨细胞和软骨细胞中的相对端粒酶活力分别为91.2、46.4和13.7,而在成熟区组织中则检测不到端粒酶活性。RT-PCR法检测的各组织细胞中TERTmRNA的表达水平与端粒酶活性检测结果一致。[结论]在鹿茸快速生长阶段,其增殖区表达端粒酶,并且端粒酶活性随组织层细胞的分化程度的增高而逐渐降低,说明端粒酶可能在鹿茸的生长过程中起重要的调控作用。     

鹿茸再生关键组织角柄骨膜基因组DNA甲基化分析

为研究鹿茸再生过程中的分子调控机制,利用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(Fluorescence-labeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)方法,分别从组织和细胞水平检测致敏区角柄骨膜(Potentiated pedicle periosteum,PPP)和休眠区角柄骨膜(Dormant pedicle periosteum,DPP)的基因组DNA甲基化水平。结果表明:无论在组织还是细胞水平,PPP的DNA甲基化水平均低于DPP,并且差异显著(P0.05)。通过人工制造致敏区角柄骨膜(artificial PPP,a PPP)对试验结果进行了功能验证,证明鹿茸再生过程中,DNA甲基化是重要的分子调控机制,DNA去甲基化是激活鹿茸角柄骨膜再生能力的先决条件。     

通过组织移植揭示鹿生茸区骨膜与鹿茸形态关系的研究

鹿生茸区骨膜是角柄和初角茸生长的组织基础,然而,控制鹿茸生长形状的信息存在于何处目前尚不清楚,本研究利用鹿生茸区骨膜移植试验来揭示这一问题。结果表明,在角柄发生前将鹿生茸区骨膜移植到鹿的前额皮下后,第1年诱发生长了角柄或单枝鹿茸,第2年再生了具有眉枝的典型二杠茸。这一结果表明,控制鹿茸形状的信息存在于鹿生茸区骨膜中,而不是所谓的鹿中枢系统的“鹿茸生长中心”中。     

器官形态发生探索Ⅱ:独特的哺乳动物模型鹿茸

生物电编码器官形态发生在低等动物中已被证实.由于缺乏哺乳动物的形态发生研究模型,二者之间的关系是否同样适用于哺乳动物至今依然未知.鹿茸是一个复杂的哺乳动物附属器官,其形态发生信息存储于形态发生原胚(鹿前额未来生茸区的骨膜)中.该文1)综述了鹿茸的形态发生原胚及鹿茸发生与再生的影响因素,提出了鹿茸是哺乳动物器官形态发生研究的最佳模型的观点;2)分析了鹿茸形态发生信息的存储位点和复制方式、转移路径,并预测了通过生物电追踪形态发生信息来破解哺乳动物器官生物电密码的研究思路.总之,通过鹿茸这一模型的研究必将为人类器官形态发生的探索奠定理论基础.     

MiRNA－93－5p 对 VEGF 的转录调控及其与梅花鹿茸细胞增殖的关系1）

为了探讨miRNA－93－5p对梅花鹿血管内皮生长因子（ VEGF）的转录调控作用及其与鹿茸细胞生长的关系,分离了鹿茸顶端软骨组织细胞,利用Trizol试剂法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿VEGF基因的3′端非编码区部分序列（3′UTR）特异引物并进行克隆,构建VEGF基因的3′UTR野生型及其突变体序列双荧光素酶报告基因载体并进行荧光素酶活性检测。再将人工合成的miRNA－93－5p模拟物转染鹿茸软骨细胞,MTT法检测鹿茸细胞体外增殖的变化;Western blotting分析VEGF蛋白的表达丰度。结果表明：成功获得了鹿茸组织VEGF基因的3′UTR序列,野生型序列长度为356 bp,突变体长度为336 bp。荧光素酶活性检测结果表明,转染野生型质粒组细胞荧光素酶活性降低,而转染突变体组细胞荧光素酶活性无明显变化。 MTT法和Western blotting结果显示,鹿茸细胞的体外增殖受到抑制,VEGF蛋白的表达水平下降,且呈时间依赖性。     

中国农业科学院特种动物干细胞创新团队

正特种动物干细胞创新团队,以梅花鹿、狐狸、水貂等特种经济动物生产性状相关细胞簇为研究重点,通过精准的组织采样、细胞培养和离体检测模型,揭示这些细胞在鹿茸生长、毛皮性状等生产性能中扮演的角色,利用分子生物学技术寻找生产性能相关的调控基因,进而提高这些特种经济动物的生产性能。该团队在基础研究方面揭示鹿茸再生的分子基础和内在调控机制;技术应用方面成功构建能够有效表达和生产生物活性因子的鹿茸生物反应器,拟表达一种生物活性因子;人才培养方面已     

中国农业科学院特种动物干细胞创新团队

<正>特种动物干细胞创新团队,以梅花鹿、狐狸、水貂等特种经济动物生产性状相关细胞簇为研究重点,通过精准的组织采样、细胞培养和离体检测模型,揭示这些细胞在鹿茸生长、毛皮性状等生产性能中扮演的角色,利用分子生物学技术寻找生产性能相关的调控基因,进而提高这些特种经济动物的生产性能。该团队在基础研究方面揭示鹿茸再生的分子基础和内在调控机制;技术应用方面成功构建能够有效表达和生产生物活性因子的鹿茸生物反应器,拟表达一种生物活性因子;人才培养方面已     

中国农业科学院特种动物干细胞创新团队

<正>特种动物干细胞创新团队,以梅花鹿、狐狸、水貂等特种经济动物生产性状相关细胞簇为研究重点,通过精准的组织采样、细胞培养和离体检测模型,揭示这些细胞在鹿茸生长、毛皮性状等生产性能中扮演的角色,利用分子生物学技术寻找生产性能相关的调控基因,进而提高这些特种经济动物的生产性能。该团队在基础研究方面揭示鹿茸再生的分子基础和内在调控机制;技术应用方面成功构建能够有效表达和生产生物活性因子的鹿茸生物反应器,拟表达一种生物活性因子;人才培养方面已     

低氧诱导因子-1与肝癌的研究现状

低氧诱导因子-1（HIF-1）是由两个亚基组成的异源二聚体体蛋白,其活性主要是由a亚基的稳定性来调节。它在低氧条件下被激活,特异性地与靶基因的低氧反应元件结合,并诱导靶基因转录,提高肿瘤细胞的低氧适应能力,利于其生长、增殖、转移。其机制包括促进肿瘤干细胞的分化,调节肿瘤细胞的代谢,促进肿瘤新生血管形成,抗肿瘤细胞凋亡等。近年有许多关于HIF-1与肝癌及肝癌细胞的研究,本文综述了其与肝癌发生、发展和治疗的研究现状。     

东北梅花鹿Galectin-1基因RNAi载体的构建

构建东北梅花鹿galectin-1基因特异小分子干扰RNA(shRNAs)真核干扰载体,并获得稳定感染生茸区骨膜细胞系。设计2对galectin-1 mRNA特异性shRNAs,两端分别带有ClaⅠ/MluⅠ酶切位点和一个9 nt发夹结构,通过基因克隆技术将其插入真核表达质粒pLVTHM中,构建galectin-1 shRNA表达载体,利用PCR和测序筛选出阳性质粒。将重组质粒与PPAX及pMD2.G共转染到293 t细胞中,在倒置显微镜下观察转染效果并收集、浓缩病毒质粒,感染生茸区骨膜细胞。结果表明,成功构建东北梅花鹿galectin-1基因RNAi载体,获得稳定传代被感染生茸区骨膜细胞系,为进一步研究galectin-1基因在鹿茸再生中的作用奠定基础。     

中国农业科学院特种动物干细胞创新团队

正特种动物干细胞创新团队,以梅花鹿、狐狸、水貂等特种经济动物生产性状相关细胞簇为研究重点,通过精准的组织采样、细胞培养和离体检测模型,揭示这些细胞在鹿茸生长、毛皮性状等生产性能中扮演的角色,利用分子生物学技术寻找生产性能相关的调控基因,进而提高这些特种经济动物的生产性能。该团队在基础研究方面揭示鹿茸再生的分子基础和内在调控机制;技术应用方面成功构建能够有效表达和生产生物活性因子的鹿茸生物反应器,拟表达一种生物活性因子;人才培养方面己培养博士生5人,研究生11人,客座研究生6人,引进博士生8人。     

鹿茸角软骨细胞体外培养方法的建立及生长特性分析

【研究目的】建立梅花鹿鹿茸软骨细胞体外分离培养和扩增方法,观察鹿茸软骨细胞在体外培养的生物学特性,为鹿茸再生机理的研究奠定基础;【方法】体外分离培养鹿茸软骨细胞,采用组织学、MTT比色法、免疫组化等多种手段动态检测细胞生长增殖情况;【结果】核心部分,约150字鹿茸软骨细胞贴壁生长,原代细胞比传代生长速度快,原代及传代4代内的鹿茸软骨细胞均有活跃的增殖能力,软骨细胞呈三角形,多边形等多种形态,II型胶原免疫组化,甲苯胺蓝染色为阳性;【结论】体外分离培养鹿茸软骨细胞具有较强的增殖能力,传代培养4代内细胞生长旺盛并维持其生物学特性,可满足后续实验研究要求。