苹果蠹蛾β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及mRNA表达稳定性检测

【目的】克隆苹果蠹蛾(Cydia pomonella(L.))的β-actin基因cDNA全长,确定其作为内参基因的可能性。【方法】运用RT-PCR和RACE技术分段扩增苹果蠹蛾β-actin基因5′和3′非编码区及保守区,拼接后根据所获序列设计引物,完整克隆苹果蠹蛾β-actin基因。利用生物信息学软件对苹果蠹蛾β-actin基因编码的蛋白质进行分析预测;通过实时定量PCR和半定量PCR方法,检测不同发育阶段以及杀虫剂处理后苹果蠹蛾β-actin mRNA的表达情况。【结果】苹果蠹蛾β-actin基因cDNA全长1 466bp(GenBank登录号为KC832921),包括5′非编码区67bp、3′非编码区268bp和开放阅读框1 131bp,编码一个由376个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的蛋白质相对分子质量为41.793 7ku,等电点为5.29,含有3个actin蛋白家族的典型识别特征以及6种类型的特定功能位点,氨基酸序列与其他昆虫β-actin一致性高达99%。实时定量PCR和半定量PCR结果表明,β-actin基因在苹果蠹蛾发育不同时期以及杀虫剂处理后表达量无显著差异(P0.05)。【结论】苹果蠹蛾β-actin基因可作为可靠的内参基因应用于基因mRNA的表达定量研究。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

棉花抗细胞凋亡基因GhDAD1的克隆、定位及表达分析

【目的】克隆陆地棉抗细胞凋亡新基因GhDAD1,为陆地棉细胞凋亡的分子机制提供依据,为培育不早衰陆地棉品种提供理论基础。【方法】采用RT-PCR以及电子克隆获得陆地棉GhDAD1的基因组序列以及全长cDNA序列并进行生物信息学分析,然后通过荧光原位杂交(FISH)技术进行染色体定位,利用real-timePCR进行表达模式分析,分析6-BA、乙烯、H2O2、SA以及NO对GhDAD1表达量的影响。【结果】棉花GhDAD1编码阅读框全长354bp,包含5个外显子,4个内含子以及232bp的5′非编码区和280bp的3′非编码区。氨基酸序列分析表明,GhDAD1蛋白属于DAD家族,与柑桔、拟南芥GhDAD1蛋白的相似性分别为91%和88%,起始密码子区符合Kozark规则,内含子剪接位点符合GT-AG规则。FISH技术将GhDAD1定位于染色体长臂上。real-time PCR分析表明,陆地棉各组织中均表达该基因,花和种胚等幼嫩组织表达量较高,并且随着衰老的进行,表达量降低。利用6-BA、乙烯、水杨酸、一氧化碳以及双氧水处理中棉所10号,qRT-PCR分析表明,6-BA、水杨酸处理能够延缓衰老,增加GhDAD1的表达量;乙烯能够加速衰老,降低GhDAD1的表达量;H2O2对GhDAD1的表达量的影响不大;而NO不同浓度影响不一样,随着浓度的升高,GhDAD1的表达量先升高后降低【。结论】陆地棉中存在抗细胞凋亡基因(GhDAD1)。     

中华豆芫菁β-actin基因cDNA的克隆、序列分析及表达量检测

【目的】克隆中华豆芫菁(Epicauta chinensis Laporte)β-actin基因全长cDNA序列,并检测其在相对实时定量研究中作为内参基因的可靠性。【方法】采用RT-PCR和RACE技术扩增中华豆芫菁β-actin基因全长cD-NA序列,利用生物信息学软件对其进行序列分析;并用实时定量PCR方法检测在中华豆芫菁雄性成虫脑、中肠、精巢和脂肪体4种不同组织中及注射刺激和非刺激条件下β-actin基因的表达量。【结果】中华豆芫菁β-actin基因全长1 673bp,其中5′非编码区88bp,3′非编码区455bp,开放阅读框为1 120bp,编码376个氨基酸,推测其编码蛋白分子质量约为93.6ku,理论等电点为5.09,富含6类特定功能位点,其氨基酸序列与其他昆虫的β-actin序列一致性可达97%～99%;实时定量PCR结果显示,该基因在中华豆芫菁不同组织、注射刺激与非刺激情况下表达量无显著差异(P>0.05)。【结论】中华豆芫菁β-actin基因可作为基因表达定量研究中的可靠内参。该基因的cDNA序列已递交GenBank,获得登录号为JQ764814。     

青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因的克隆与表达分析

【目的】对青海湖裸鲤TOB1和TOB2基因进行克隆及表达分析,为揭示其在青海湖裸鲤生长和生理过程中的作用奠定基础。【方法】采用PCR和RACE技术克隆青海湖裸鲤中TOB1和TOB2基因的cDNA全长序列,对其特性进行了生物信息学分析。以β-actin为内参基因,采用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测TOB1和TOB2基因在3龄成鱼肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织及发育12,72,120,168,216 h胚胎中的表达水平。【结果】青海湖裸鲤TOB1 cDNA全长为1 734 bp,5′非编码区为466 bp,3′非编码区为296 bp,开放阅读框长972 bp,编码323个氨基酸。TOB2 cDNA全长为2 785 bp,5′非编码区为51 bp,3′非编码区为1 582 bp,开放阅读框为1 152 bp,编码383个氨基酸。TOB1和TOB2在N端均具有明显的BTG家族结构域,且系统进化分析显示2个TOB蛋白与鲤科鱼类同源性较高,亲缘较近。qRT-PCR结果表明,TOB1和TOB2在3龄成鱼的肾脏、肠、鳃、脑、心脏、肌肉等组织中均有表达;TOB1在3龄成鱼的心脏组织中表达量最高,其次为脑和肌肉组织,在鳃组织中的表达量最低;TOB2在3龄成鱼的脑组织中表达量最高,其次为肌肉。TOB1及TOB2在不同发育时期胚胎中均有表达,且都在12 h胚胎中表达量最高。【结论】TOB1及TOB2在3龄成鱼各个组织及胚胎中均有表达,但表达量有较大差异,表明2个基因均具有时空表达特异性。     

越橘VcANS基因的克隆及表达分析

【目的】从越橘果实中克隆花色素合成酶（ANS）基因cDNA,为研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。【方法】以越橘（Vaccinium spp.）品种“北陆”（V.corymbosum L.）为试材,并以Illumina测序文库（NCBI登录号：SRA046311）中差异表达的Unigene 38125片段为基础,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得花色素合成酶基因全长cDNA,利用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和系统进化分析,探讨ANS基因在不同组织和器官中的相对表达量及其与对应花色素苷含量的关系。【结果】成功克隆了越橘花色素合成酶基因序列,命名为VcANS,GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1 424 bp,包含93 bp的5′非编码区、248 bp的3′非编码区和1个长度为1 083 bp编码360个氨基酸的开放阅读框,该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2酮戊二酸和Fe²⁺依赖的氧化酶超家族的保守结构域。序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。在越橘果实发育的不同阶段,VcANS相对表达量的变化与花色素苷含量的变化趋势具有一致性。【结论】获得了越橘花色素合成酶基因全长,推测其对越橘花色素苷的形成起调控作用。     

猪繁殖候选基因ERK2的克隆、表达及基因多态分析

 【目的】ERK2基因在细胞增殖和分化调控以及启动卵巢排卵的分子信号等过程中发挥重要作用,是影响猪繁殖性状的重要候选基因。本试验对猪ERK2基因序列、基因结构、基因多态性及其表达规律进行初步研究。【方法】以大白猪为材料,采用RT-PCR方法克隆了猪ERK2基因,Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的分布,并对该基因的结构和多态性进行分析。【结果】从猪卵巢组织中克隆获得ERK2基因部分cDNA序列,长1 888 bp,包括一个1 080 bp的开放阅读框,编码359个氨基酸与预测的猪ERK2基因、已报道的人和小鼠等的ERK2基因高度相似;猪ERK2基因在各组织中表达广泛,其中脾脏是表达量最高的组织,在脂肪组织、前后腿肌中基本不表达;猪ERK2基因定位于14号染色体,全长在22 kb以上,包含9个外显子和8个内含子;对第2—9外显子及内含子外显子交界处的内含子序列进行序列突变检测,共检测到11个SNPs和1个插入缺失突变,但绝大部分的变异都是在内含子区域,仅有1个SNP发生于3′UTR区域。【结论】猪ERK2基因cDNA为1 888 bp,编码359个氨基酸残基;在猪各组织中广泛分布,以脾脏的表达量最高;该基因由9个外显子和8个内含子组成,基因保守性较高,共检测到11个SNP和1个插入缺失突变均不在编码区中。     

巨桉EgrCBF3基因的克隆与逆境响应表达分析

【目的】克隆巨桉(Eucalyptus grandis)抗逆相关基因EgrCBF3(GenBank登录号:JQ068829)的全长cDNA序列,分析EgrCBF3在低温、干旱、脱落酸(ABA)处理和高盐条件下的表达。【方法】利用RT-PCR结合RACE技术,克隆巨桉抗逆相关基因EgrCBF3全长cDNA序列;分析正常条件下,巨桉根、茎和叶中EgrCBF3的表达情况;同时采用qRT-PCR,分析不同低温(0,2,4,6,8℃)和4℃处理不同时间(2,4,8,24和48h),以及干旱、ABA和高盐等逆境条件下EgrCBF3的响应表达情况。【结果】EgrCBF3cDNA全长1 161bp,含有1个675bp的ORF,编码224个氨基酸,包含1个AP2结构域。该基因编码的蛋白与蓝桉中的CBF蛋白同源性最高,达97%。EgrCBF3在巨桉的叶、茎和根中均有表达,但表达量无明显差异。对不同低温和4℃不同处理时间条件下EgrCBF3表达的qRT-PCR分析表明,EgrCBF3基因受低温诱导,在2℃条件下诱导表达量最强;在4℃条件下随低温时间的延长,其诱导表达特性不变,仅略有波动。在100μmol/L ABA、200mmol/L NaCl和干旱处理条件下,EgrCBF3的表达不受ABA和盐胁迫的影响,但在干旱胁迫下被诱导。【结论】EgrCBF3响应低温胁迫诱导,同时可能也参与了干旱胁迫的逆境响应机制。     

苹果GMP、GME和GGP基因的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannose pyrophosphorylase,GMP)、GDP-甘露糖-3′,5′-表异构酶(GDP-mannose-3′,5′-epimerase,GME)和GDP-1-半乳糖磷酸酶(GDP-L-galactose-1-phosphate phosphorylase,GGP)的基因序列并分析其表达特性,探讨GMP、GME和GGP基因在抗坏血酸(Ascorbic acid,AsA)合成过程中的作用。【方法】以‘嘎啦’苹果幼果为材料,分别运用RT-PCR和PCR法克隆GMP、GME和GGP基因的cDNA和gDNA全长序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR,分析以上基因在苹果不同组织(幼叶、成熟叶、衰老叶、花、幼果、成熟果和根)中的表达情况。【结果】RT-PCR法克隆及序列分析显示,GMP基因的cDNA全长为1 280bp,编码361个氨基酸,gDNA序列中含有3个内含子;GME基因的cDNA全长为1 323bp,编码376个氨基酸,gDNA序列中含有5个内含子;GGP基因的cDNA全长为1 677bp,编码446个氨基酸,gDNA序列中含有6个内含子。基因表达的实时荧光定量PCR分析表明,GMP、GME和GGP在苹果不同组织中均有表达,在叶片中的表达量高于其他组织,且表达量随着叶片的生长逐渐升高;在花、幼果和成熟果中,GMP、GME和GGP的表达量差异不明显。【结论】克隆获得了苹果的GMP、GME和GGP基因,其在苹果不同组织的生长过程中有不同的表达特性,但GME的表达水平远远低于GMP和GGP,这在一定程度上表明,在苹果AsA的生物合成过程中,GMP、GGP较GME有更重要的作用。     

苦瓜MAP30基因克隆与单倍型分析

【目的】以揭示苦瓜MAP30完整基因结构及单倍型为目的,为研究MAP30基因表达调控机制提供参考。【方法】以34份苦瓜初级核心种质为材料,参考苦瓜基因组序列,克隆MAP30基因,利用多种生物信息学软件分析苦瓜MAP30完整基因结构及单倍型。【结果】苦瓜MAP30基因全长920 bp,包括52 bp的5′-UTR,7 bp的3′-UTR,861 bp的ORF,无内含子序列,编码286个氨基酸。系统进化分析表明:MAP30蛋白与葫芦科其他植物的RIPs蛋白亲缘关系较远,MAP30蛋白在苦瓜属植物中保守性较强。通过比较34份苦瓜种质资源MAP30基因序列,共发现6个SNP位点,第1个SNP位于5′-UTR区,其余5个SNP位于编码区。SNP分组发现:34份苦瓜种质资源MAP30基因共存在3种单倍型。3种单倍型编码的氨基酸序列比对显示:共存在3个氨基酸变异位点,分别是第2位M/V、第69位R/H、第74位N/D,3个氨基酸变异位点分别对应于第2、3、4 SNP位点,第5、6 SNP位点并未引起氨基酸的改变。【结论】本研究克隆了MAP30完整基因结构并分析了MAP30蛋白与葫芦科其他植物的RIPs蛋白的亲缘关系,另外分析了不同苦瓜种质MAP30基因SNP分布情况及单倍型种类。     

梅花鹿Ghrelin全长cDNA克隆及其序列分析

为获得梅花鹿Ghrelin cDNA全序列,以梅花鹿皱胃黏膜上皮组织提取的总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE法克隆了梅花鹿皱胃中Ghrelin基因cDNA的全序列。结果表明梅花鹿Ghrelin cDNA序列全长为539bp,其中5’非翻译区(5’UTR)为46bp,3’UTR为128bp,开放阅读框(ORF)为351bp,该ORF编码116个氨基酸残基。将梅花鹿Ghrelin基因的cDNA与人和其他动物的Ghrelin相比,发现:梅花鹿Ghrelin与驯鹿、山羊、绵羊和牛的同源性达90.4%~99.1%;与恒河猴、人、猪、犬的同源性达76.6%~66.9%;与鸡和野鸽的同源性分别为36.4%和35.4%。研究表明Ghrelin的结构具有明显的种属特异性,因此Ghrelin在反刍动物体内可能有着重要的生理功能。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一。本研究克隆了七彩神仙鱼（Symphysodon haraldi） Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析。结果表明：七彩神仙鱼Vasa 基因cDNA序列共2 370 bp,其中5''UTR占123 bp,3''UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp。氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的同源性最高。半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号。qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达。在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低。在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量。繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反。本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考。     

猪LPAR3基因克隆及其在子宫内膜细胞的表达

【目的】获得猪LPAR3基因完整mRNA及基因结构,研究其启动子活性;探究LPAR3基因在子宫内膜的转录调控及可能影响母猪产仔的机制。【方法】应用5'RACE和3'RACE技术获取LPAR3基因完整mRNA序列;预测5'调控区潜在的启动子转录因子结合位点及CpG岛,构建不同长度的启动子双荧光素酶报告基因重组载体,与pRL-TK质粒共同转染至猪子宫内膜细胞,检测启动子活性;应用RT-qPCR比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的相对表达量;应用亚硫酸氢钠修饰后测序比较LPAR3基因在妊娠第12天的二花脸猪和长大二元猪子宫内膜的甲基化状态。【结果】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,其中5'UTR和3'UTR的长度分别为202和860 bp,CDS区为1 065 bp。克隆获得包括LPAR3转录起始位点上游3 080 bp (–2 430/+650bp)的5'调控序列,分析预测显示该调控区不存在TATA box,存在GC元件、CPBP及糖皮质激素受体IR3等调控因子结合位点,且在–190/–84和–44/+651 bp处存在2个潜在CpG岛。成功构建9个不同长度的5'缺失报告重组载体并转染猪子宫内膜细胞。双荧光素酶活性检测结果显示,启动子P4(+454/+80 bp)的转录活性最高,其次是P6(–123/+80 bp)。RT-qPCR结果显示,妊娠第12天二花脸猪LPAR3基因在子宫内膜的表达量高于在其他组织的表达量,且极显著高于在妊娠第12天长大二元猪子宫内膜的表达量,LPAR3在2个猪种子宫内膜均处于低甲基化状态且差异不显著。【结论】猪LPAR3 mRNA全长为2 127 bp,妊娠第12天LAPR3基因在二花脸猪子宫内膜表达高于其在长大二元猪子宫内膜的表达,显示LPAR3可能参与了猪早期妊娠并影响产仔数。     

斑鳜胃蛋白酶原C及其5'侧翼区的克隆及序列特征分析

采用RT—PCR和RACE等技术克隆了斑鳜（Sinipercascherzeri）胃蛋白酶原C（pepsinogenC,PGC）的cDNA全长和部分DNA序列,结果表明：PGCcDNA序列全长1505bp,5’端非翻译区37bp,3’端非翻译区304bp,开放阅读框架（ORF）1164bp,共编码含有387个氨基酸的蛋白质,包括由16个氨基酸组成的信号肽、39个氨基酸的激活肽和332个氨基酸的成熟肽。斑鳜PGC氨基酸序列与斜带石斑鱼、伯氏豚虾虎鱼、狼鲈、美洲红点鲑4种鱼的相似度分别为92．0％、91．5％、90．2％、89．1％,与非洲爪蟾、鸡、人、兔、褐家鼠的序列相似度分别为76．8％、72．8％、72．5％、69．9％、67．3％,表明PGC基因在长期的进化中较为保守。PGC基因由9个外显子和8个内含子组成,内含子剪切位点符合GT—AG规则,在第7含子中发现（GACA）6、（CA）6类型的微卫星序列,第8内含子中发现（TG）,类型的微卫星序列。采用锚定PCR方法获得了PGC5’侧翼区长1924bp的序列,启动子区域位于-40～＋10bp,包含TATA盒以及GATA-1、CdxA、Hand1／E47、AP-1、Nkx-2、S8、FOX J2等转录因子的结合位点。结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

阳江地区尾叶桉早期生长性状遗传参数估算

目的 研究尾叶桉Eucalyptus urophylla无性系的遗传变异,筛选适合阳江地区生长的优良无性系,为新品系选育及推广应用提供科学依据。方法 以76份尾叶桉无性系为研究材料,在阳江地区分3次营建尾叶桉无性系测定林;造林后逐年测量其树高和胸径,并对该生长性状进行方差分析和遗传参数估算,采用多性状基因型值筛选优良无性系,并估算入选优良无性系的遗传增益。结果 尾叶桉的树高和胸径在无性系间存在显著差异,且生长性状的变异系数逐年递减。除少数年份内的生长性状外,尾叶桉生长性状方差分量在区组间的差异达到了显著或极显著的水平,遗传方差分量介于0.10~22.61之间,环境方差分量介于0.18~45.86之间,重复力介于0.10~0.42之间。除1年生树高外,树高和胸径存在较强的遗传正相关,遗传和表型相关都达到中等及较高的水平（相关系数为0.40~0.98）,且相同林龄内的树高和胸径间相关性较大。根据不同林龄预测的树高和胸径基因型值,结合树高和胸径的生长表现,在所有林龄的无性系中,无性系ZQUB29、ZQUA34、ZQUC33、ZQUA15和ZQUA33的表现都较好,表明这些无性系可能在整个轮伐期长势都较稳定,是优良无性系。结论 参试尾叶桉无性系间生长差异极显著,入选的5个优良无性系可作为后续尾叶桉遗传改良和良种选育的基础。     

暗纹东方鲀sox9基因的克隆和组织表达分析

为初步探究暗纹东方鲀sox9基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过设计兼并引物、RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀sox9基因的cDNA全长序列,并分析其相应的生物信息学特征及其在雌雄个体的组织表达水平。结果表明:sox9a基因cDNA全长为1 248 bp(NCBI登录号:MH218818),包括684 bp的ORF,编码227个氨基酸,297 bp的5′UTR和267 bp的3′UTR。sox9b基因全长为1 941 bp(NCBI登录号:MH218819),包括1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,306 bp的5′UTR和165 bp的3′UTR。同源性和系统发育分析结果表明暗纹东方鲀sox9基因与红鳍东方鲀同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示两个Sox9氨基酸序列的HMG box结构域在哺乳动物和鱼类中均高度保守。荧光定量PCR分析显示两个sox9基因普遍存在于雌鱼和雄鱼的各个组织中,且均在雌鱼下丘脑中表达量最高,在精巢中有少量表达,卵巢中几乎不表达。总体来说,除少数组织外,两个sox9基因在雌鱼组织中的表达量普遍高于雄鱼。本研究为了解暗纹东方鲀sox9的遗传特性及相关的生理功能,探索性别分化与性腺发育的分子调控机制提供理论依据。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜(Brassica napus)基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域:两性N末端区(anamphipathicN-terminalre鄄gion),中心疏水区(acentralhydrophobicdomain),两性C-末端区(anamphipathicC-terminaldomain)。     

尾叶桉响应水肥单、双因素胁迫的差异表达基因分析

【目的】比较尾叶桉Eucalyptus urophylla对水肥单、双因素胁迫的分子响应机制,为桉树抗逆育种提供思路和分子基础。【方法】以无性系ZQUA44为试验材料,设3个水肥胁迫处理和1个对照(CK)。水肥双因素胁迫:20%～40%田间持水量,基肥[钙镁磷肥(CMPF) 250 g];水分单因素胁迫:20%～40%田间持水量,基肥(CMPF250 g+复合肥150 g);养分单因素胁迫:60%～80%田间持水量,基肥(CMPF 250 g);CK:60%～80%田间持水量,基肥(CMPF 250 g+复合肥150 g)。水分单因素胁迫和对照在种植2个月后施尿素100 g,8月份施复合肥150 g,第2年春天施复合肥100 g。对受胁迫处理的尾叶桉进行生长指标测定,并取叶片进行转录组测序,对测序结果进行拼接,利用生物信息学手段获得差异表达基因,对差异基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。最后随机选择4个具有不同表达模式的差异表达基因进行qRT-PCR,验证转录组测序数据的可信度。【结果】3种胁迫处理均在一定程度上抑制尾叶桉的生长发育,胁迫处理下尾叶桉各项生长指标多显著低于对照。水肥双因素胁迫、水分单因素胁迫和养分单因素胁迫处理共得到5 547个差异表达基因,分别有2 585、1 472和1 490个差异表达基因,各有1 195、222和665个基因表达上调和1 390、1 250和825个基因表达下调;3种胁迫处理分别获得155、75和108个基因编码转录因子。水肥单、双因素处理的差异表达基因均显著富集在苯丙烷的生物合成路径中。qRT-PCR结果与转录组测序结果基本一致,说明测序结果可信。【结论】尾叶桉在3种胁迫处理下的转录变化具有明显的普遍性和特异性,综合胁迫对植物生长的影响比单独胁迫的影响更大,不同胁迫条件下植物可能具有不同的响应方式。     

凡纳滨对虾繁育相关基因Allatostatin-AR的克隆与表达分析

咽侧体抑制素主要抑制昆虫咽侧体保幼激素的分泌,是昆虫体内重要的神经肽,在甲壳动物体内可能参与繁殖发育的调节。本研究利用RACE PCR技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)A型咽侧体抑制素受体(Allatostatin-A receptor,AST-AR)基因进行克隆,获得全长为2 650 bp的cDNA,包括1 425 bp的开放阅读框,1 170 bp 5''非编码区,55 bp 3''非编码区,编码474个氨基酸,形成具有7个跨膜区的不稳定亲水性蛋白。同源性和系统发育分析结果表明凡纳滨对虾AST-AR基因与斑节对虾(Penaeus monodon)、美洲龙虾(Homarus americanus)同源性最高,亲缘关系最近。氨基酸多重序列比对结果显示AST-AR氨基酸TM7后C末端精氨酸在不同物种之间高度保守。实时荧光定量PCR结果显示,AST-AR基因在雌、雄凡纳滨对虾多个组织(眼柄、脑、胃、肝胰腺、鳃、性腺、肠、肌肉)中均有表达,除脑组织外AST-AR基因在雌性凡纳滨对虾中相对表达量高于雄性。在幼体发育中,AST-AR基因的相对表达量随发育阶段上升,同时该基因在不同群体仔虾生长对比实验中表达量差异显著。据此推测AST-AR基因参与凡纳滨对虾的繁殖、幼体发育、幼虾生长到成虾,基因表达基本贯穿凡纳滨对虾的一生。     

小麦TaSIM基因结构及表达分析

根据小麦TaSIM基因的cDNA序列设计引物,采用PCR技术从小麦中克隆TaSIM基因的DNA序列,采用半定量RT-PCR方法研究TaSIM基因在不同组织中的表达。结果表明:TaSIM编码区DNA序列长度为2 355bp,包含2个外显子和1个内含子。分析发现内含子富含AT,在内含子中发现2个MYB转录因子结合位点。半定量RT-PCR检测表明,TaSIM基因在不同组织中均有表达,在雄蕊中的表达量最高。TaSIM表达量依次为雄蕊>雌蕊>根>茎>叶。