苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子的转化及其转录活性

【目的】研究6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子(S6PDHp)的组织表达特点。【方法】利用Gateway技术构建了S6PDHp与GUS基因的融合表达载体,然后通过农杆菌介导法转化番茄"中蔬5号",对转基因植株进行PCR检测,对鉴定为阳性的植株进行GUS组织化学染色,验证S6PDHp的组织表达特性。【结果】将S6PDHp-GUS融合表达载体转化番茄,经PCR检测显示,成功获得了转S6PDHp基因的阳性番茄植株。对阳性植株各组织器官的GUS化学染色和活性检测结果显示,除叶片外许多器官都有很强的GUS活性,且在转基因番茄成熟期植株的茎部活性最高,根部活性最低;叶片从新叶到老叶的各个时期,GUS活性持续降低。【结论】S6PDHp表达在植物衰老过程中降低;且在转基因番茄茎部的GUS活性最强,说明该启动子具有组织表达特异性。     

杂交鹅掌楸LhFB1基因启动子的克隆及活性分析

【目的】研究杂交鹅掌楸LhFB1基因启动子(pLhFB1)的活性,为研究该基因功能及相关机制提供参考。【方法】利用染色体步移法(Genome Walking)克隆LhFB1基因上游5′侧翼调控区序列,利用生物信息学软件PlantCARE分析其包含的顺式作用调控元件。构建pCAMBIA1300-pLhFB1重组载体,对本氏烟草幼苗期叶片进行瞬转注射和GUS染色表达。花序浸染法将重组载体转化至野生型拟南芥,GUS组织染色分析其在T_2代转基因植株开花期根、茎、叶和花组织中的表达量,并用qRT-PCR对GUS组织染色进行活性验证。【结果】pLhFB1启动子序列长1 780 bp,含有多个TATA-box和CAAT-box及压力响应、激素响应、光信号转导、代谢循环元件。瞬转结果表明,烟草叶片注射部位有蓝色斑点,说明启动子有活性。遗传转化结果表明,转pLhFB1启动子拟南芥根、茎、叶和花组织中都有不同程度的蓝色,且根和茎中的蓝色斑块较深。qRT-PCR结果说明,pLhFB1启动子在拟南芥根、茎、叶和花组织都有表达,与GUS染色结果基本相符。【结论】克隆得到pLhFB1启动子序列,其在转拟南芥植株各组织中都有活性,但以根和茎中较强。     

水稻氨基酸透性酶基因OsAAP14启动子克隆及时空表达特性分析

【目的】克隆水稻氨基酸透性酶基因OsAAP14的启动子序列并分析其时空表达特性，为解析氨基酸转运基因生物学功能及了解水稻对有机氮源的响应和氨基酸吸收利用提供理论依据。【方法】PCR扩增OsAAP14基因的启动子序列，并与pCAMBIA1391Z空载体质粒连接构建出启动子-GUS表达载体，并通过农杆菌介导侵染水稻中花11愈伤组织，获得OsAAP14基因的启动子-GUS转基因植株，通过对转基因植株不同组织部位进行GUS染色，并采用石蜡切片技术观察各组织细胞部位表达，经5种不同氨基酸处理后进行根部GUS染色，结合实时荧光定量PCR检测OsAAP14基因在GUS染色部位的相对表达量，最后综合分析该基因的时空表达特性。【结果】克隆获得OsAAP14基因启动子序列为1993 bp，与参考序列日本晴OsAAP14（LOC_Os04g56470）序列一致。该启动子序列含有MBS、P-box、ABRE、CGTCA-motif等激素或胁迫响应元件。从OsAAP14基因的启动子-GUS植株T₀代中鉴定获得16个阳性转基因株系。T₁代材料不同组织部位GUS染色及实时荧光定量PCR结果均显示，OsAAP14基因在水稻芽伸长的基部和叶片相对表达量较高，在根、叶鞘和穗也有一定表达，但在茎中的相对表达量最低。石蜡切片分析结果显示，OsAAP14基因在根部皮层薄壁细胞、叶片的叶肉细胞、穗的颖壳内部细胞有较高的表达。碱性氨基酸的组氨酸处理下根中的OsAAP14基因表达量随着处理时间的增加显著提高（P<0.05，下同），且赤霉素和脱落酸处理下，根中的OsAAP14基因相对表达量也显著提高。【结论】OsAAP14基因在水稻不同组织均有表达，正常情况（未处理）下在水稻基部和叶片中相对表达量较高，但外源氨基酸和激素处理时，在根中该基因被诱导表达上调，说明OsAAP14基因正常情况下可能主要参与调控水稻地上部分氨基酸的运输，但当外界氨基酸和激素含量增加时则参与调控水稻根部氨基酸的运输。     

水稻基因启动子OsBTF3p的克隆和启动活性分析

 【目的】分子克隆水稻基因OsBTF3启动子片段,明确其对靶基因表达的启动作用,为抗病转基因水稻研究提供理论依据和启动子元件材料。【方法】对OsBTF3编码区上游1387 bp的启动子（OsBTF3p）序列进行了克隆和序列分析,构建了OsBTF3p∷GUS融合基因植物表达载体pCAM-OsBTF3p,利用农杆菌介导的水稻遗传转化,获得了39株OsBTF3p∷GUS转基因植株,对OsBTF3p进行了启动活性、组织特异性及病原菌诱导性分析。【结果】分子克隆了OsBTF3p片段,其序列与GenBank中的已知序列一致。在转基因水稻愈伤组织中能够检测到GUS活性,表明该启动子具有启动活性。在转基因水稻叶片维管束组织和根部组织能检测到GUS活性。水稻白叶枯病菌(Xoo)侵染后OsBTF3p驱动的GUS活性明显地上调表达。【结论】OsBTF3p具有驱动GUS基因表达的启动活性、组织表达特异性和病原菌诱导性。     

玉米根部特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】从玉米幼根基因组DNA中克隆β-葡萄糖苷酶基因根部特异性启动子序列ZmGLU1P,并对其功能进行分析。【方法】利用PCR技术从玉米品种P138幼根基因组DNA中克隆玉米根部特异性启动子片段ZmGLU1P,将其与GUS基因融合,构建植物表达载体pCAMBIA121-ZmGLU1P,转化到EHA105根癌农杆菌中,通过根癌农杆菌介导法转化烟草NC89,对转化烟草植株进行PCR和Southern杂交检测。采集PCR和Southern杂交检测为阳性的转基因烟草的根、茎、叶,进行GUS活性的组织染色检测。【结果】克隆获得了ZmGLU1P片段,其长度为1 846 bp,与已报道的序列同源性达99%以上。转基因烟草植株的PCR和Southern杂交结果显示,成功地获得了转基因阳性植株;GUS活性检测表明,根中GUS活性最强,而在茎和叶等组织中GUS活性甚微,表明ZmGLU1P片段具有根部特异性启动子功能。【结论】玉米β-葡萄糖苷酶基因上游1 846 bp的片段ZmGLU1P具有根部特异性启动子功能,为根部特异性启动子。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

百合花药和雌蕊特异启动子功能分析

【目的】从"索邦"百合(Lilium orential"Sorbonne")中克隆查尔酮合成酶基因启动子相似序列PCHS2,并对其进行表达模式分析。【方法】从"索邦"百合中PCR扩增PCHS2启动子序列,与GUS报告基因融合,构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana var.Columbia)和矮牵牛(Petuniahybrida "Dreams Midnight"),抗性筛选和PCR检测鉴定转基因植株,GUS组织化学检测分析启动子在转基因植株中的表达模式。【结果】转基因拟南芥和矮牵牛的抗性筛选和PCR检测结果显示,成功地获得了转基因阳性植株。GUS活性分析表明,在PCHS2的驱动下,仅能在花药和雌蕊中检测到GUS活性,茎、叶和其他花组织中都没有发现GUS活性的表达。【结论】PCHS2启动子具有花药专一性。     

水稻基因启动子Ospz1的克隆与表达特性研究

在水稻基因组芯片分析的基础上,克隆到一个在水稻中高水平表达基因OsSG15'末端启动子区域1.6-kb的DNA片断,即Ospz1启动子,构建了由Ospz1启动子引导的GUS重组基因,并经农杆菌介导将重组基因导入到水稻中.对转基因水稻植株中GUS活性的定性测定结果表明,Ospz1启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片、芽和根中高效表达,而在其它器官中不表达或表达活性极弱,表现出组织特异性.Ospz1启动子可用于农作物生物技术的遗传改良.     

百合花特异启动子PchsA表达载体的构建及功能分析

【目的】分析从百合中克隆获得的查耳酮合成酶基因(chsA)启动子的组织表达特性。【方法】将chsA启动子片段插入到双元表达载体pCAMBIA 1381中,成功构建了植物表达载体pCAMBIA-CHS,通过根癌农杆菌EHA 105转化拟南芥,用50 mg/L潮霉素对转化植株进行筛选,对阳性植株进行PCR检测和GUS组织化学分析。【结果】PCR检测表明,chsA启动子片段已经整合到拟南芥基因组中,GUS组织化学分析显示,在拟南芥花序中有很强的GUS活性,叶腋处有微量表达,其他组织中不表达。【结论】初步证明百合chsA启动子为花特异表达启动子。     

小麦花粉电穿孔转化因素优化和转基因植株获得及鉴定

[目的]通过优化电穿孔转化技术主要参数,得到候选转基因植株,探索普通小麦(Triticum aestivum L.)电穿孔遗传转化体系.[方法]以冬小麦品种济麦19为受体,GUS为外源基因,将扬花期成熟花粉以最适电场强度和操作温度进行电穿孔处理后,人工授粉济麦19,最终收获种子;利用PCR技术、Southern技术、化学染色方法对T1、T2植株进行鉴定.[结果]电穿孔转化以电场强度6 kV·cm-1、冰上处理花粉,花粉密度为5×106个/mL,以及去雄后第5天授粉为最佳参数;Southern杂交检测结果表明,T2阳性植株的2个株系检测到杂交信号,同时其幼根、叶片等组织经GUS表达活性的组织化学染色检测,呈现蓝色反应.[结论]利用小麦花粉电穿孔转化法可以成功将外源基因整合到小麦基因组中并稳定遗传至T2,且外源基因GUS能够得到表达.     

‘南通小方柿’赤霉素不敏感基因DkGAI2的克隆与功能分析

【目的】 对DkGAI2的亚细胞定位及表达特性进行分析,并将DkGAI2转化烟草,分析转基因烟草的生理和形态指标,为GAI的深入研究提供理论基础。【方法】 以‘南通小方柿’高通量转录组测序结果中标注的GAI2为原始序列（未发表）,利用RT-PCR,3′ RACE和5′ RACE技术从‘南通小方柿’中克隆得到DkGAI2的序列全长。利用生物信息学分析其序列特征,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析DkGAI2在‘大方柿’及‘南通小方柿’5个不同物候期的表达特性以及DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中的表达特性,构建瞬时表达载体pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2,并瞬时侵染烟草分析DkGAI2的亚细胞定位,通过构建DkGAI2植物双元表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草,经过GUS染色、RT-PCR对转基因烟草株系进行鉴定;并将野生型和转基因烟草移栽,于第一朵花开放时测定转基因植株的株高、节间长度、叶片长宽比以及GA₁和GA₄含量。【结果】 从‘南通小方柿’中克隆得到了1 827 bp的DkGAI2,DkGAI2核苷酸序列与猕猴桃（KF588651.1）、光皮烨（MF149049.1）、砂梨（KX078214.1）、苹果（FJ535245.1）、葡萄（MG738718.1）的相似度达72%-80%,DkGAI2具有DELLA蛋白家族特有的DELLA结构域,属于DELLA蛋白基因家族。DkGAI2编码608个氨基酸,相对分子质量为66.5 kD,理论等电点为5.54,不稳定系数为50.41,无明显疏水区,无跨膜区,无信号肽。序列系统进化分析结果显示,DkGAI2与葡萄亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量都高于‘大方柿’;DkGAI2在‘南通小方柿’不同组织中表现出组织表达特异性,其中,在老叶中表达量最高,其次为茎尖和幼叶,而在幼果中几乎不表达。pCAMBIA-GFP-1302-DkGAI2融合蛋白的绿色荧光信号位于细胞核中,表明DkGAI2编码蛋白位于细胞核。经过GUS染色和RT-PCR检测,共获得5个转DkGAI2烟草株系,转基因烟草叶片GA₁含量增加,GA₄含量降低,GA₁和GA₄总含量降低,且转基因烟草植株出现植株矮化、节间缩短、叶片长宽比降低及花期延迟的表型。【结论】 DkGAI2具有组织表达特异性,定位于细胞核,DkGAI2在‘南通小方柿’5个不同物候期的表达量均高于‘大方柿’。推测DkGAI2可能通过降低GA₄的含量进而引起植株矮化。     

盐生植物盐爪爪液泡膜钠氢反向运输载体基因(KfNHX1)遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定

【目的】 研究盐爪爪液泡膜Na⁺/H⁺反向运输载体KfNHX1 (AY825250) 基因的耐盐功能,为耐盐育种提供候选基因。【方法】 采用农杆菌介导花序浸染的方法,将KfNHX1转入拟南芥中,结合基因组PCR和RT-PCR方法鉴定符合3∶1分离比的转基因株系;利用在盐胁迫下的萌发率、根长和表型分析,结合原子吸收分光光度计法测定叶片的Na⁺、K⁺含量,推断其耐盐性。【结果】 对抗生素筛选符合3∶1的转基因纯合株系进行基因组PCR和RT-PCR分析,证实KfNHX1基因在拟南芥基因组中整合和表达。盐胁迫下转基因株系的拟南芥种子的萌发率和根长明显高于野生型。200 mM NaCl胁迫处理15 d的拟南芥成苗,相较野生型叶片萎黄和死亡,转基因植株的生长表型较好,且积累了较高的Na⁺和K⁺。外源ABA的处理下,转基因植株的发芽率和生长表型也好于野生型。【结论】 盐爪爪(Kalidium foliatum)是一种藜科(Chenopodiaceae)盐生灌木,对盐的耐受性很强。液泡膜Na⁺/H⁺反向运输体(NHX)是在离子稳态中起重要作用的膜蛋白,通过调节胞间离子的跨膜转运来维持细胞内离子和pH平衡。盐生植物盐爪爪KfNHX1能够提高转基因拟南芥的耐盐性,具有提高植物耐盐性的潜力。     

越橘VcNAC072克隆及其促进花青素积累的功能分析

目的 分离越橘VcNAC072（NAM,ATAF1/2,CUC2）转录因子,分析其表达模式并探讨其在调控花青素合成过程中的功能,为进一步研究越橘花青素积累的调控机理提供理论基础。方法 以‘公爵’越橘（Vaccinium corymbosum ‘Duke’）为试材,克隆VcNAC072。通过农杆菌介导法获得转基因拟南芥,比较转基因和野生型拟南芥花青素积累的差异。利用酵母单杂交和瞬时表达试验,分析VcNAC072对MYB转录因子AtPAP1的转录调控。结果 克隆获得越橘VcNAC072,该基因CDS为1 032 bp,编码含有343个氨基酸的蛋白质,含有1个保守的NAC结构域。表达分析显示,该基因在不同发育阶段的果实中均可表达,但表达差异明显,在粉色和蓝色果实中表达量较高,在绿色果实中表达量最低。随着VcNAC072表达的升高,果实中花青素含量呈递增的趋势。分析AtPAP1启动子序列,发现其序列中包含NAC转录因子的结合位点。酵母单杂交和烟草瞬时表达试验结果表明,VcNAC072可与AtPAP1的启动子相互作用,并激活其表达。在野生型拟南芥中异位表达VcNAC072,其种子中花青素积累量显著高于野生型。结论 推测VcNAC072在越橘果实中正向调节花青素的积累。     

水稻稻瘟病抗性基因在抗性育种中的研究进展

【目的】 从水稻稻瘟病抗性的机理、抗性基因的定位、克隆以及抗性基因在育种中的应用,为水稻抗性基因的鉴定和抗性育种提供参考。【方法】 汇总和对比分析国内外的相关文献,分析不同抗性基因在水稻抗稻瘟病中的应用研究进展。【结果】 已有大约100个抗性基因被鉴定出和500个抗病基因相关的数量性状位点;在水稻基因组中被鉴定和定位的基因中,已有37个基因被成功克隆;在不同的育种方法中,基因工程育种是水稻稻瘟病抗性育种中最直接的方法。【结论】 水稻稻瘟病抗性基因的鉴定是抗性育种的基础,抗性基因的充分利用有利于快速有效的选育出新的具有广谱和持久抗性的抗病品种。     

棉花PsbS基因对烟草光合特性的影响

【目的】分析光系统II PsbS基因在不同光照条件下,光系统II PsbS基因的功能 。【方法】利用转棉花PsbS基因的烟草(Nicotiana tabacum xanthin),T3代株系及非转基因(普通野生型,wt)烟草为材料,比较两者的生物学性状(叶面积、叶绿素含量)及在不同光强(75、240、450 μmol/(m²·s))下的生理(光合作用)性状。【结果】转基因植株前期叶面积增长较快,叶绿素组成成分的含量也存在差异,叶绿素a、b含量显著高于野生型烟草,转基因烟草具有更强的光合能力,并伴随着气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)提高。【结论】转PsbS 基因可以提高烟草光合能力。     

新疆红肉苹果果实性状及MYB10启动子基因型鉴定分析

【目的】 分析新疆红肉苹果(Malus sieversii f. Neidzwetzkyana (Dieck) Langenf.)的果实特性及MYB10基因的启动子类型,为研究新疆的红肉基因类型及红肉苹果资源的利用研究奠定基础。【方法】 测定果实单果重、纵径、横径等性状指标并观察果肉颜色,设计引物,利用PCR克隆的方法,进行启动子类型检测。【结果】 果肉颜色多为淡红色,丝状或片状分布,HX-1为血红色果肉全红,单果重变异系数较大,最大单果重为124.57 g,果形指数最大值1.01,最小值0.82;可溶性固形物最大值17.36,最小值10.66;果梗粗最大值2.50 mm,最小值1.02 mm;果梗长度最大值34.36 mm,最小值13.48 mm;MYB10启动子类型全部为R₆R₁型。【结论】 29份资源的果实性状的遗传多样性较为丰富,果肉的呈色各有特点,但MYB10启动子类型全部一致为R6R₁型。     

陆地棉细胞色素P450超家族基因GhCYP85A2-1的克隆与功能分析

【目的】研究细胞色素P450超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能,为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】 采用同源克隆方法,从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhCYP85A2-1,利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing, VIGS)构建GhCYP85A2-1基因沉默载体,利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】 GhCYP85A2-1基因沉默植株的株高显著降低,基因的表达量也显著下降。【结论】 GhCYP85A2-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。