一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年～2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%～99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以10~6EID_(50)SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log_(10)EID_(50)/mL、4.8 Log_(10)EID_(50)/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。     

一株猪流感病毒的遗传进化分析及其致病力研究

为研究猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)A/swine/Dezhou/37/2015(H1N1)株的遗传进化和致病力,本研究对该分离株的8个基因节段进行了遗传进化分析,并接种小鼠观察临床表现及检测其肺脏的病理变化情况。结果显示:分离株HA基因的裂解位点为PSIQSR↓G,无多个连续碱性氨基酸插入,为低致病性SIV;HA、M、NA节段处于欧洲类禽H1N1分支;NP、PA、PB1、PB2节段处于2009甲型H1N1分支;NS节段处于北美三源重排分支;对小鼠致病力研究显示该毒株可感染小鼠并引起其肺脏组织病理学变化,但对小鼠无致死性。以上结果表明该分离株为一株低致病性的新型三源重排SIV。本研究为山东地区SIV的流行特点及变异情况提供了实验依据。     

广东省猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了解广东地区猪流感病毒(SIV)的流行和变异情况,本研究于2013年10月至2014年1月从广东省4个不同地区采集猪鼻拭子和肺脏病料共203份,对样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测,从中分离得到5株SIV,对其进行病毒纯化、全基因组测序和遗传进化分析。结果表明,5株SIV分离毒株其中3株为H1N1亚型,2株为H1N2。分离毒株HA裂解位点位于PSIQSR↓GL,具有典型的低致病性流感病毒特征。HA基因序列比对结果显示,5株SIV分离毒株与A/Jiangsu/ALS1/2011(H1N1)株同源性最高,核苷酸相似性为97%~99%。遗传进化分析结果显示,5株分离毒株的PB2、PB1、PA和NP基因片段属于PDM/09分支,M基因片段以及外部基因片段HA属于欧亚类禽分支,NS基因片段属于北美三元重组分支,3株H1N1亚型的NA基因属于欧亚类禽分支,2株H1N2亚型的NA基因属于人季节性流感分支。抗原位点分析结果表明,分离毒株的抗原位点基本保守,但YJ28分离株HA1蛋白上发现3个氨基酸突变,分别是L69S、S137P、E222G。本研究通过对广东省不同地区分离到的SIV进行鉴定分析,掌握SIV的变异趋势,为猪流感的防控提供切实有效的理论依据。     

类禽H1N1亚型与Pdm/09H1N1亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及其遗传进化分析

为了解猪流感病毒(SIV)的流行情况,本试验在2014年10月-2015年9月期间在广东省各地区采集猪的鼻拭子和肺脏病料,将样品处理之后进行鸡胚分离和RT-PCR检测,分离到1株SIV,对其进行全基因组测序和遗传进化分析,结果表明为H1N1亚型SIV,病毒HA,NA,M和NS基因片段属于类禽分支(EA),病毒PB2、PB1、PA和NP基因片段属于Pdm/09分支。HA基因序列同源性结果显示,核苷酸相似性为93.2%~99.1%,其中与A/swine/Jiangxi/3858/2011(H1N1)SIV同源性最高。抗原位点分析结果表明,分离毒株的抗原位点基本保守。本研究通对广东省各地区分离的SIV分析,为SIV的重组和变异趋势及公共卫生安全的防控提供依据。     

一株H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析以及生物学特性研究

本实验室于2016年在江西分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Jiangxi/261/2016(H1N1),为进一步弄清该株流感病毒的遗传进化背景和生物学特点,本研究对其进行了全基因组测序,遗传进化分析,BALB/c小鼠致病性试验,抗原性差异试验,受体结合特性试验。测序结果显示该病毒HA碱性裂解位点仅具有一个碱性氨基酸,符合低致病性流感病毒特点。外部基因来自欧亚类禽,内部基因来自2009/H1N1(PB2、PB1、PA、NP),欧亚类禽(M)和Triplereassortant H1N2(NS)。10~6 EID_(50)/50μL剂量可感染小鼠并致死,HA抗原性差异试验结果显示其与欧亚类禽Group1代表株差异较小,受体结合试验结果显示该病毒株主要结合α-2,6唾液酸受体。其传播性和致病性增强机理还有待进一步研究,本实验结果为SIV的检测和防控提供借鉴意义。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的遗传演化分析及在雪貂体内复制和飞沫传播能力评估

本实验室于2016年在天津分离到一株猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Tianjin/312/2016(H1N1)(简称为TJ312株)。为了解该株病毒的生物学特性及遗传演化特征,本研究对经PCR分段扩增该病毒全基因组并测序,采用SeqMan软件拼接成全基因组序列经BLAST比对,得到与该SIV各基因节段序列同源性最高的病毒株,采用mafft分析其各基因节段编码氨基酸序列的分子特征,利用MEGA5.1软件分别构建该病毒8个基因节段的进化树。结果显示,SIV TJ312株各基因节段与2016年分离自天津的H1N1 SIV相应各基因节段的同源性在99%～100%。进化树结果显示该病毒株HA、NA和M基因均来自欧亚类禽H1N1 (EA H1N1) SIV谱系;PB2、PB1、PA和NP基因来自2009/H1N1流感病毒谱系;NS基因来自北美三重配H1N2 SIV谱系。蛋白分子特征分析结果显示,HA蛋白碱性氨基酸裂解位点序列为PSIQSR↓G,符合低致病性流感病毒分子特征;受体结合位点符合人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的分子特性;NA蛋白aa275为H、aa295为N,且该蛋...     

携带H1N1 pdm09基因的重配猪流感病毒分子流行特征研究进展

在2009年甲型H1N1流感(H1N1 pdm09)大流行暴发初期,该病毒就已经成功地潜入到了猪群当中,继而参与到了猪流感病毒(SIV)的进化过程,通过不断地重配和适应,促进了新型SIV变异毒株的产生。目前,世界各地的猪群中普遍流行着携带有H1N1 pdm09基因片段的新型SIV,其重配形式呈现多样化。值得一提的是,由于H1N1 pdm09毒株的内部基因具有广泛的基因相容性,不同亚型、不同谱系的人源流感病毒、禽源流感病毒和本地猪流感病毒更倾向与它们优先发生重组。重配后的子代病毒较亲本毒株容易获得选择优势,能够在猪群中建立稳定的遗传谱系。研究发现H1N1 pdm09部分独特的内部基因片段在其高效的人际间传播过程中发挥着决定性的作用。一旦这类新型SIV成功突破种间屏障,获得适应新的哺乳动物的能力,将会对人类健康造成潜在的威胁。论文综述了携带有H1N1 pdm09基因的新型重配SIV的分子流行情况,特别就H1N1 pdm09内部基因与重组病毒致病性、传播能力等相关的分子基础进行了系统地综述,为防控新型SIV的暴发和保障公共卫生安全提供依据。     

一株猪流感病毒A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)的分离鉴定及遗传进化分析

为鉴定上海地区猪流感病毒的流行株及其分子生物学特征,本研究从上海地区养殖场采集疑似流感症状的猪咽拭子样品40份,采用套式PCR结合鸡胚分离鉴定方法,从中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)。经全基因组测定和遗传进化分析结果显示该分离株的8个基因节段与欧亚类禽H1N1 SIV同源性最高,其PB2、PB1、PA基因节段可能来源于A/swine/Jiangsu/49/2012(H1N1)病毒,NA、NP和M基因节段可能来源于A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)病毒。该分离病毒的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI,为低致病性流感病毒的分子特征。该分离株NA蛋白未出现与神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变,M2蛋白S~(31)N突变表明该病毒可能对金刚烷胺类药物具有一定的耐药性。PA蛋白~(224)S和PB2蛋白~(701)N突变提示该分离株对哺乳动物的适应性增强,可能导致其致病性增强,需要加强对此类SIV的监测。结合近年来的监测表明,上海地区猪群中H1N1亚型SIV持续存在,需要持续跟踪监测SIV变异趋势。本研究为防控猪流感提供实验依据。     

1株H1N1亚型猪流感病毒的全基因组特征及其对小鼠的致病性

旨在了解河南省猪流感病毒的流行情况及其遗传进化和基因组特征。2018年4月，从河南省某一出现疑似流感症状猪群中采集鼻拭子样品150份用于分离病毒，对分离病毒的全基因组进行序列测定和分析。同时感染6周龄BALB/c小鼠，研究其对小鼠的致病性。结果显示，获得1株H1N1亚型病毒[命名为A/swine/Henan/NY20/2018（H1N1）]。遗传进化表明，其HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支，PB2、PB1、PA、NP和M基因属于2009甲型H1N1分支，NS基因属于经典H1N1分支。HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓GL，具有低致病性流感病毒的分子特征，在小鼠肺和鼻甲有效复制并能引起肺组织病理学变化。本研究分离到1株3源重排H1N1亚型病毒，对小鼠呈现一定致病力，提示应进一步加强对SIV的监测。     

2株H1N1猪流感病毒的遗传进化分析及其生物致病性

对挑选的2株猪流感病毒A/swine/Guangdong/BRT15/2016(H1N1,BRT15)和A/swine/Guangdong/YJ4/2014(H1N1,YJ4)进行遗传进化分析与小鼠致病性试验。全基因组序列的遗传进化分析结果显示,BRT15与YJ4的HA、NA、M基因属于欧亚类禽猪源流感病毒分支,NP、PA、PB1和PB2基因属于pdm/09分支,NS基因属于北美三元重组分支。分别将BRT15与YJ4感染BALB/c小鼠进而比较分离株对小鼠的致病力,结果显示BRT15与YJ4毒株对小鼠具有不同的致病力,YJ4攻毒组小鼠死亡率高于BRT15组。肺部滴度检测显示,感染病毒后3d,YJ4组病毒滴度显著高于BRT15(P0.01),感染病毒后6d,YJ4和BRT15组病毒滴度无明显差异(P0.05);脑部滴度检测显示,感染病毒后3,6d,YJ4组和BRT15组病毒滴度均无明显差异(P0.05)。     

重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫效力研究

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)对商品肉鸡的免疫保护效果,本研究将该疫苗按照现地免疫程序分别接种10日龄白羽肉鸡和14日龄黄羽肉鸡,疫苗接种前和接种后每周采血,分离血清,检测H5亚型Re-8株和H7亚型H7-Re1株禽流感病毒(AIV)HI抗体滴度,并在初次免疫后3周和出栏时以鼻腔感染方式分别进行攻毒试验。结果显示,免疫前,所有肉鸡血清中H7亚型H7-Re1株AIV HI抗体滴度均低于1log2,H5亚型Re-8株AIV平均HI抗体滴度分别为5.3log2(白羽肉鸡)和4.1log2(黄羽肉鸡);一次免疫的白羽肉鸡在免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度在6.0log2~6.7log2;2次免疫的黄羽肉鸡在初次免疫后3周至出栏时,2种亚型AIV平均HI抗体滴度均在6.0log2以上。在一次免疫后3周时和出栏时,采用高致病性H5、H7亚型AIV攻毒后,对照组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均全部死亡,免疫组白羽肉鸡和黄羽肉鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护。本研究结果表明,重组AIV二价灭活疫苗对商品肉鸡具有良好的免疫效果,为该疫苗的现地应用提供了参考依据。     

猪PBD1成熟肽基因在干酪乳酸杆菌中的表达及其抑菌活性的检测

为获得一株能够稳定表达猪β防御素-1 (PBD1)成熟肽蛋白的重组干酪乳酸杆菌,本研究将PBD1成熟肽基因克隆至含有短小干酪乳酸杆菌信号肽的pUCK-SP载体中,再将SP-PBD1亚克隆到干酪乳酸杆菌整合性表达质粒pMJ67的Lac启动子下游,获得重组质粒pMJ67-SP-PBD1,电转化入干酪乳酸杆菌,经红霉素抗性筛选和基因组DNA PCR测序鉴定,证实猪PBD1基因整合到了干酪乳酸杆菌中。采用半定量RT-PCR分析显示,经2%乳糖诱导18 h后的重组菌中猪PBD1 mRNA含量最高。Western blot检测显示,经乳糖诱导的重组菌表达了约5.8 ku的目的蛋白,与PBD1成熟蛋白理论分子量相符。抑菌试验结果显示重组PBD1对葡萄球菌具有明显抑制作用。表明猪PBD1基因在重组干酪乳酸杆菌中获得了表达,且具有抑菌活性。本研究为进一步研发具有广谱抗菌作用的微生态制剂奠定了基础。     

弓形虫突触融合蛋白STXQa1对虫体生长的作用研究

为揭示弓形虫突触融合蛋白STXQa1在虫体生长过程中的作用,本研究利用ddFKBP系统构建了STXQa1的条件性过表达虫株。利用间接免疫荧光试验(IFA)观察STXQa1的亚细胞定位,通过westen blot及IFA检测STXQa1蛋白的表达;经IFA检测STXQa1蛋白过表达虫株在细胞内的增殖能力、侵入细胞的能力以及逸出细胞的能力。结果显示STXQa1定位在虫体空泡样隔室(VAC);利用shield1能够快速调控ddFKBP-STXQa1融合蛋白的表达;过表达STXQa1对弓形虫的细胞内增殖具有抑制作用,同时影响弓形虫的侵入及逸出能力。本研究通过对弓形虫独特的突触融合蛋白STXQa1的表达与鉴定,为进一步研究弓形虫分泌细胞器的成熟和蛋白的分泌机制研究奠定了基础。     

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_tufA-cre质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。     

猪IL-21的真核表达及其与CD40L共刺激抗体分泌的活性研究

为研究猪白介素21(IL-21)的生物学功能,本研究在猪IL-21基因(456 bp)的3’端加上猪Ig G Fc标签序列后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建重组质粒pcDNA-IL-21-Fc。将该重组质粒转染293T细胞瞬时表达后,利用protein A亲和纯化介质纯化转染上清中的目的蛋白,并检测其纯度与生物学活性。结果显示,构建的重组质粒pcDNA-IL-21-Fc能够在293T细胞中表达相对分子量约为44 ku的猪IL-21融合蛋白;亲和纯化后的猪IL-21融合蛋白能够与CD40L协同呈剂量依懒性地刺激猪外周血淋巴细胞(PBMCs)分泌Ig G。本研究为进一步探究猪IL-21在适应性免疫应答中的作用提供依据。     

抗伪狂犬病病毒干扰素刺激基因的筛选及IFIT3抗病毒活性的鉴定

为研究抗伪狂犬病病毒(PRV)特异性的干扰素刺激基因(ISGs),本研究采用与表达增强型绿色荧光蛋白报告病毒相结合的高内涵筛选系统对具有抗病毒功能的10种ISGs进行筛选,之后利用过表达细胞系、间接免疫荧光(IFA)和qRT-PCR试验对显著抑制PRV复制的IFIT3(<0.01)进行抗病毒活性验证,通过qRT-PCR检测了PRV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)和PRV感染猪的外周血单核细胞(PBMC)中IFIT3mRNA的转录水平。高内涵筛选结果显示,5种潜在的抗PRVISGs分子(IFIT3、ISG15、GBP2、Mx1和ISG20)对PRV的复制具有显著的抑制作用,其中IFIT3效果最显著;IFA和qRT-PCR试验结果显示,在PK-15细胞和PAM中,过表达IFIT3均可以显著降低PRV-TJ株的病毒滴度和基因组拷贝数;qRT-PCR试验结果显示,在PRV感染的PAM和PBMC中,IFIT3mRNA的转录水平均显著上调。流式细胞术试验表明过表达IFIT3不影响PK-15细胞凋亡,推测IFIT3可能存在其它的抗病毒机制。本研究筛选到5种潜在的抗PRVISGs并证实IFIT3是一种抗PRV的ISG,为抗PRVISGs的相关研究,特别是猪源IFIT3抗病毒机制的研究奠定了基础。     

东北地区狐源大肠杆菌耐药性的检测

通过对东北地区狐源大肠杆菌进行分离培养,并对其耐药性展开调查。采用纸片扩散的方法测定各分离菌株对22种抗菌药物的敏感性。旨在为养殖场抗菌药物的正确使用和控制其耐药性提供重要的科学依据。结果表明,狐源大肠杆菌各个菌株对各种抗菌药物的敏感性不同。对氨苄西林、头孢噻吩、卡那霉素、四环素、氯霉素、强力霉素和复方新诺明的耐药率均在60%以上;对阿米卡星、多黏菌素B敏感率在80%以上,而对亚胺培南敏感率在90%以上。     

猪链球菌2型05ZYH33菌株启动子的筛选和鉴定

为了筛选和鉴定用于猪链球菌(S.suis)致病因子和致病机制研究的启动子,本研究通过质谱鉴定了来自S.suis2型05ZYH33菌株的5个高丰度蛋白质,并通过其驱动GFP蛋白和甘露糖苷酶SSU05_1921的表达水平,评估了这5个蛋白相应的基因启动子的强弱。结果显示,这5种蛋白质分别为SSU05_0177、SSU05_0530、SSU05_1503、SSU05_1815和SSU05_1868,相应的5个启动子P0177、P0530、P1503、P1815和P1868均能够有效驱动GFP在E.coli和S.suis中的高水平表达,但是P1815、P0177和P1868不能驱动SSU05_1921在S.suis中的表达。P0530和P1503能够驱动SSU05_1921在S.suis中的表达,并且P1503启动子驱动GFP和SSU05_1921的表达水平均比P0530启动子驱动的高两倍以上。因此,P0530和P1503是S.suis的强启动子,并且P1503更强于P0530。这在高水平表达GFP用于标记菌体,以及构建无启动子基因的回复突变菌株中发挥关键作用,在S.suis遗传操作中具有很好的应用前景。     

凯氏定氮法与杜马斯燃烧法检测饲料粗蛋白质含量的比较

为比较凯氏定氮法与杜马斯燃烧法测定饲料中粗蛋白质含量的准确性与检测效率,采用此两种方法同时对12个样品进行测定。结果表明:两种方法均能准确检测出样品中粗蛋白质含量,测定结果差异不显著(P>0.05)。凯氏定氮法检测效率较低,而杜马斯燃烧定氮法操作简易,检测效率较高,是值得推广的检测方法。     

一株H5N3亚型禽流感病毒全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型流感病毒的生物学特性,本研究对2017年浙江省分离到的一株H5N3亚型禽流感病毒(AIV)[DK/ZJ/S1368/2017(H5N3)]进行了遗传演化分析及小鼠感染性实验。遗传演化分析结果显示,该株病毒的HA蛋白裂解位点处仅含一个碱性氨基酸,属于低致病性AIV。同时,该病毒的血凝素(HA)基因与H5N7亚型流感病毒亲缘关系较近;聚合酶碱性蛋白2(PB2)基因和核蛋白(NP)基因与H10N7亚型流感病毒亲缘关系较近;碱性聚合酶蛋白1(PB1)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近;酸性聚合酶蛋白(PA)基因与H6N2亚型流感病毒亲缘关系较近;神经氨酸酶(NA)基因与H10N3亚型流感病毒亲缘关系较近;基质蛋白(M)基因与H3N8亚型流感病毒亲缘关系较近;非结构蛋白(NS)基因与H1N1亚型流感病毒亲缘关系较近。表明其基因来源复杂。小鼠感染实验结果显示,该分离株无需提前适应即可以在小鼠肺脏和鼻甲中复制,小鼠感染病毒后无明显临床症状,与对照组相比其体质量变化不明显,表明该病毒对小鼠呈低致病性。本研究通过对该H5N3亚型AIV的生物学特性的分析,发现该病毒基因来源复杂,无需提前适应就可以在小鼠体内复制,具有感染哺乳动物的潜在威胁,提示应当持续加强对H5N3亚型AIV的监测和相关生物学特性的研究工作。