姜黄素固体分散体在猪体内的比较药动学研究

本研究首次建立了测定猪血浆中姜黄素的高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS），比较了在内服给药途径下，姜黄素固体分散体和姜黄素预混剂在仔猪体内的药动学特征。选用16头7周龄左右健康二元杂交猪（约克夏×长白），公母各半，随机分为2组，每组8头，按100 mg·kg^-1（以姜黄素计）分别灌服姜黄素固体分散剂和姜黄素预混剂，不同时间点采集血浆样品，经提取、净化后采用HPLC-MS/MS测定血浆中姜黄素的药物浓度，使用WinNonlin 5.2.1软件非房室模型计算、分析姜黄素在猪体内的药动学参数。结果显示，仔猪灌服姜黄素固体分散体和姜黄素预混剂后的药时曲线下面积（AUC）分别为（104.53±38.67）和（37.82±11.48）h·ng·mL^-1；达峰时间（T_max）分别为（3.25±0.38）和（2.31±0.37）h；峰浓度（C_max）分别为（26.65±9.65）和（9.55±2.75）ng·mL^-1；消除半衰期（t_1/2β）分别为（3.55±2.17）和（6.93±0.86）h；平均驻留时间（MRT）分别为（5.23±0.53）和（4.26±0.47）h，统计分析表明，与预混剂相比，仔猪灌服姜黄素固体分散体后，主要药动学参数差异显著（P<0.01），T_max明显延迟，C_max显著提高，AUC明显增大，姜黄素固体分散体的相对生物利用度为280.39%。结果表明，姜黄素固体分散体可改善姜黄素在肠道的吸收，提高姜黄素的生物利用度，为今后姜黄素固体分散体的开发和临床应用提供科学依据。     

基于PK/PD模型对恩诺沙星可溶性粉在鸡混饮给药方案的药效再评价

旨在对不同日龄雏鸡开展恩诺沙星可溶性粉混饮给药的药动学研究,并利用获得的药动学参数通过PK/PD模型结合Monte Carlo模拟（Monte Carlo simulation,MCS）评价恩诺沙星可溶性粉推荐给药方案的合理性。分别在1、7和14日龄雏鸡进行恩诺沙星可溶性粉75 mg·L^-1（以恩诺沙星计）混饮给药,按预定时间点采集血样,采用经验证的HPLC法测定各时间点每只鸡的血药浓度,拟合药动学参数。将获得的药动学参数与美国临床和实验室标准协会（CLSI）给出的恩诺沙星对禽大肠杆菌的敏感性折点值（0.25 μg·mL^-1）结合计算PK/PD参数,并通过MCS获得当前给药方案在大肠杆菌不同MIC分布下的达标率（target attainment rate,TAR）。结果显示,1、7和14日龄雏鸡3个处理组在第0天达峰浓度（C_max）分别为0.561、0.564和0.550 μg·mL^-1,24 h曲线下面积（AUC_0-24）分别为8.85、9.85和9.27 μg·h·mL^-1;3个处理组给药第4天C_max分别为0.599、0.550和0.487 μg·mL^-1,平均稳态血药浓度（C_avg）分别为0.513、0.493和0.432 μg·mL^-1,AUC_0-24分别为12.31、11.82和10.37 μg·h·mL^-1,C_max/MIC分别为2.40、2.20和1.95,C_avg/MIC分别为2.05、1.97和1.73,AUC_0-24/MIC分别为49.24、47.28和41.48。恩诺沙星对MIC≤0.25 μg·mL^-1的大肠杆菌临床分离株,1、7和14日龄雏鸡给药期间TAR为75.01%～76.11%。以上结果表明,恩诺沙星可溶性粉按目前的推荐给药方案对敏感菌PK/PD参数比值和TAR均达不到预期,不仅杀菌效果有限,且易诱导细菌产生耐药性。     

沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊的特性分析

旨在制备并表征沙拉沙星/β-环糊精（SAR/β-CD）包合物微囊新制剂,测定增溶倍数和包封率,进行SAR/β-CD包合物微囊的体外溶出与体内药代动力学研究。采用搅拌法制备包合物微胶囊,用透射电镜、扫描电镜和粉末X光衍射技术进行物态表征。采用液相色谱法测定SAR/β-CD包合物微囊的增溶倍数和包封率,通过溶出试验研究SAR/β-CD包合物微囊在磷酸盐缓冲液（pH6.8）中的释放规律。最后,进行了环糊精包合物微囊在鸡体内的药代动力学评价。理化表征试验证明,药物进入β-环糊精空腔,成功获得了SAR/β-CD包合物微囊。3个试验批次的SAR/β-CD包合物微囊的平均增溶倍数和平均包封率分别为（25.3±1.15）倍和90.3%±0.15%。在磷酸盐缓冲液（pH6.8）中SAR/β-CD包合物微囊的溶出率为95.6%,而普通粉剂的溶出率仅为72.2%,包合反应后的制剂溶解度和溶出度均有显著提高。药代动力学试验中血药浓度检测的标准曲线为y=1.563 2x-0.189 6,R²=0.999 3,在0.25~10.00 μg·mL^-1内呈良好的线性关系。分析方法的精密度RSD值小于10%,分析方法的准确度大于90%,同时小于110%;回收率试验表明,低浓度（0.50 μg·mL^-1）回收率为90.55%±3.81%,中浓度（1.00 μg·mL^-1）回收率为93.85%±3.14%,高浓度（2.50 μg·mL^-1）回收率为98.19%±5.41%。冻融试验表明冻融稳定性（n=3）符合《中华人民共和国兽药典》（2015版）规定。鸡口服药代动力学试验表明,SAR/β-CD包合物微囊和沙拉沙星粉的AUC（mg·h^-1·L^-1）、T_max（h）、C_max（μg·mL^-1）分别为43.59±0.50、2.18±0.09、5.99±0.30和17.27±0.30、0.98±0.07、1.19±0.10。成功制备沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊新剂型,明显提高了药物的溶出率和生物利用度,对喹诺酮类药物的推广应用具有重要意义。     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。     

不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH（0、0.1、1、10和100 ng·mL^-1）处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h（n=3），观察细胞的生长状态，通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖，并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27^kip1的表达。结果显示，各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好，形态正常，细胞轮廓清晰，组间死亡细胞数差异不显著（P>0.05）；在0.1和1 ng·mL^-1 GnIH处理组，细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升（P<0.05）；随着GnIH处理浓度的增加，EdU阳性细胞数所占的百分比降低；在0.1和1 ng·mL^-1 GnIH处理组，颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27^kip1基因的相对表达量均下降，在10和100 ng·mL^-1 GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明，在体外培养的鸭颗粒细胞中，GnIH能使细胞周期阻滞在G2期，并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平，从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。     

基于免疫磁珠净化间接竞争酶联免疫吸附试验检测氟喹诺酮类药物

本研究旨在建立一种基于免疫磁珠进行分离、富集和净化前处理，检测鸡肉、鸡肝和鱼肉中氟喹诺酮类药物残留的间接竞争酶免疫吸附试验（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA）的研究方法。通过对合成免疫磁珠及免疫磁珠净化过程中单克隆抗体添加量、偶联时间、缓冲液pH、抗原添加量、抗原捕获时间、温度及包被条件等进行优化，初步建立了基于免疫磁珠净化的icELISA检测方法。结果显示：1）在1 mg的磁珠中，沙拉沙星（sarafloxacin，SAR）单克隆抗体最佳偶联量为15 μg，偶联时间60 min，pH为4.4；2）最佳抗原添加量为1 ng·mL^-1，捕获时间40 min，缓冲液为0.01 mol·L^-1 PBS，IC₅₀为0.73 ng·mL^-1，线性范围为1.0~3.2 ng·mL^-1；3）氟喹诺酮类药物在鸡肉、鸡肝、鱼肉的检测限均不超过1.33、2.17、2.31 μg·kg^-1，回收率为76.83%~98.70%，批内变异系数批间变异系数均不超过15%，经验证，鸡肉样本检测结果与高效液相色谱法（HPLC）结果一致。结果表明，与传统仪器检测方法相比，该方法提高了检测氟喹诺酮类药物的简便性、选择性以及检测效率，为氟喹诺酮类药物的残留检测提供了新思路。     

UV-B辐射增强和温度变化对麻花艽光响应的影响

为了确定UV-B辐射增强和温度变化对高寒草甸植物生理过程的影响,以LI-6400便携式光合测定系统控制温度和紫外灯UV-B辐射增强方法,测定分析了UV-B辐射增强和温度变化对麻花艽(Gentiana straminea Maxim.)叶片光合作用及相关生理参数的影响。结果显示:麻花艽叶片净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、胞间CO₂浓度(C_i)、蒸腾速率(E)和水分利用效率(WUE)在对照下较高,UV-B辐射为20W和40W处理下较低;8月,P_n在25℃下比15℃下显著高;9月,对照处理下P_n在25℃下比15℃下高。同时,E在25℃比15℃下高;G_s、WUE和C_i在25℃下比15℃下低。另外,麻花艽叶片P_n在光合有效辐射强度为0~800μmol·m^-2·s^-1时随光合有效辐射强度增加而增加幅度较大,800~2200μmol·m^-2·s^-1时增幅较小;G_s和E随光合有效辐射强度增加而增加;C_i在光合有效辐射强度0~800μmol·m^-2·s^-1时随光合有效辐射强度增加而呈现下降趋势,800~3000μmol·m^-2·s^-1变化不大;WUE在光合有效辐射强度0~800μmol·m^-2·s^-1时随光合有效辐射强度增加而呈现增加趋势,800~3000μmol·m^-2·s^-1时呈现下降趋势。说明UV-B辐射增强将对高寒草甸植物-麻花艽叶片光合作用及相关参数将产生极大影响,影响与温度变化有一定的关系。     

川西北高寒草甸植物根际促生菌筛选及其特性研究

为获得多功能的高寒植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）,并明确其生理生化特性,本研究采用选择性培养基法从川西北广泛分布的5种高寒草甸植物根际土壤和根系中分离了44株菌株,并对菌株的溶磷、固氮和解钾特性进行测定。结果显示：25株为溶无机磷菌株,24株为溶有机磷菌株,溶磷量分别在10.98～90.27 μg·mL^-1和10.58～64.56 μg·mL^-1之间;固氮菌株共20株,其固氮酶活性介于5.23～64.87 nmol（C₂H₄）·h^-1·mL^-1之间;解钾菌株21株,解钾量在9.23～73.21 μg·mL^-1之间。经过形态学和生理生化特征分析,最终筛选出12株兼具溶磷、固氮和解钾的多功能菌株,分子鉴定将其归属于不动杆菌属（Acinetobacter）、沙雷氏菌属（Serratia）、假单胞菌属（Pseudomoas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、戴尔福特菌属（Delftia）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）。研究结果可为川西北高原土壤微生物菌肥的开发提供优质菌源参考。     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。     

猪流行性腹泻病毒全病毒灭活疫苗量效关系研究

本研究旨在探索猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)灭活疫苗不同抗原含量对仔猪感染的保护作用。测定不同浓缩倍数PEDV感染性病毒粒子数和病毒粒子总数,用不同浓缩倍数抗原分别制备灭活疫苗免疫小鼠,利用ELISA抗体检测方法、中和试验、ELISPOT方法测定体液免疫与细胞免疫产生情况,筛选合适抗原含量疫苗进行仔猪免疫并测定抗体,利用攻毒试验研究浓缩疫苗与保护之间的关系。结果显示,当抗原含量达8×10⁶ pfu·mL^-1以上时,灭活疫苗能有效刺激小鼠产生体液免疫及细胞免疫。以2 mL含8×10⁶ pfu·mL^-1抗原的灭活PEDV疫苗免疫仔猪可抵抗PEDV攻毒引起的腹泻及连续排毒,相较于总病毒粒子数,感染性病毒粒子数与抗体产生呈显著相关(r = 0.998 1),中和效价与仔猪保护呈显著相关性(r=0.974 7)。PEDV灭活疫苗可以提供良好的免疫保护,其中感染性病毒数量是提升抗体水平的关键因子,抗体滴度作为一项体液免疫的指标是判断免疫保护的重要参考。     

旋毛虫重组二肽基肽酶1在体外对大鼠外周血单个核细胞增殖、吞噬、凋亡等的影响

本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL^-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。     

海兰褐蛋鸡ZP3基因结构及其在卵泡中表达规律分析

旨在探讨ZP3基因在海兰褐蛋鸡中的表达特性，为后期研究ZP3基因在蛋鸡卵泡发育中的作用提供理论支撑。本研究以产蛋期50周龄（50 W）海兰褐蛋鸡为试验对象，利用RACE技术克隆ZP3基因全长，并对编码区进行生物信息学分析。选择健康、体重相近的海兰褐蛋鸡6只，分别取心、肝、肺、肾、卵巢、胸肌、腿肌和不同等级卵泡构建表达谱。卵巢颗粒细胞经不同浓度（PBS、5 ng·mL^-1、10 ng·mL^-1、20 ng·mL^-1）促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）处理后，提取总RNA，采用实时荧光定量检测ZP3基因在各个样品的表达水平。结果表明，鸡ZP3基因全长1 415 bp，其中编码区1 341 bp，共编码446个氨基酸，位于10号染色体上，包含9个外显子；其亲缘关系与猪最远；跨膜结构预测表示，其含有一个跨膜结构域和一个信号肽区域；对其亲疏水性进行分析，预测该蛋白为弱的疏水性蛋白，蛋白质结构主要由无规则卷曲构成。组织表达谱显示，ZP3基因在鸡的卵巢中相对表达量最高。各等级卵泡ZP3表达分析显示，随着卵泡发育，ZP3基因在成熟卵泡（F1）颗粒细胞层表达量最高；在使用FSH处理等级颗粒细胞后，发现ZP3表达量显著上调（P<0.05），暗示ZP3基因在颗粒细胞中受到FSH激素调节。本试验对ZP3基因的结构进行了分析并预测该基因存在跨膜结构和信号肽区域。基因表达谱分析结果显示，ZP3基因在卵泡发育过程中表达量逐渐升高且主要在颗粒细胞中表达，可能受到FSH的调节作用，因此预测，ZP3基因可能与海兰褐蛋鸡繁殖功能相关。     

基于蛋白组学体外分析益母草水煎液对补体和凝血级联通路相关活性因子的作用

旨在通过蛋白组学探索益母草水煎液对人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells, HDMECs)凝血与抗凝血相关因子表达的调节作用。MTT法筛选益母草水煎液对HDMECs的安全浓度；使用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)技术分析50和100 μg·mL^-1益母草水煎液作用24 h后HDMECs蛋白表达谱的变化，通过对比各组蛋白谱的变化筛选出差异显著的相关通路，分析该通路中筛选到的可信差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)，并选取可信DEPs中与凝血与抗凝血相关的拮抗因子进行RT-PCR和ELISA验证。结果表明：1 mg·mL^-1以下益母草水煎液对HDMECs无毒副作用；益母草水煎液能够同时调节与凝血相关的血小板活化等过程和与抗凝血相关的肝素结合过程。对筛选出的补体和凝血级联通路中的5种可信DEPs分析显示，与空白组相比，50 μg·mL^-1益母草水煎液组凝血酶原(F2)、抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、凝血因子Ⅴ(F5)和激肽原(KNG)同时显著下调，100 μg·mL^-1益母草组F2、t-PA、AT-Ⅲ、KNG显著下调；与50 μg·mL^-1益母草水煎液组相比，100 μg·mL^-1益母草水煎液组F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5和KNG等凝血级联相关因子均显著升高。结果提示，益母草水煎液可显著改变HDMECs蛋白表达谱，并可能通过调控补体和凝血级联通路相关因子F2、AT-Ⅲ、t-PA、F5、KNG蛋白的表达对凝血与抗凝血相关拮抗因子发挥双向调控作用。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

大花金挖耳细胞悬浮培养及其胞内代谢产物化感潜力的研究

为了优化大花金挖耳(Carpesium macrocephalum Franch.et Sav.)细胞悬浮培养的条件,评价其胞内代谢产物的化感潜力。本文研究了无机盐浓度不同的MS,1/2MS,B5,1/2B5,NT和1/2NT等6种培养基及NT中N,P,Ca,Mg,K等5种大量元素含量对大花金挖耳悬浮培养细胞生物合成黄酮的影响,并采用微量活性测定法测定了其细胞培养物的化感潜力。结果表明:大花金挖耳细胞悬浮培养的最优基本培养基是NT,NT中总氮浓度为50.62 mmol·L^-1,NH₄⁺:NO₃^-为2:3时,黄酮含量最高为1.38%,H₂PO₄^-,Ca²⁺,Mg²⁺,K⁺等离子依次在5.00,1.50,0.50~1.00,14.39~27.81 mmol·L^-1范围内有利于大花金挖耳悬浮培养细胞的生长和黄酮合成;大花金挖耳悬浮培养细胞的粗提物对供试的紫花苜蓿(Medicago sativa L.)、刺儿菜(Cephalanoplos segetum(Bge.)Kitam.)、反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)、小白酒草(Conyza canadensis(L.)Cronq.)和小麦(Triticum aestivum L.)等5种植物幼苗根生长均具有抑制作用,毒力依次为10.66,12.32,15.85,102.16,210.96 mg·mL^-1。     

镇江河漫滩草地虉草光合特性研究

对虉草(Phalaris arandinacea)光合特性的研究表明:不同生长阶段虉草净光合速率日变化均呈双峰曲线,光合"午休"现象明显,但5月下旬主、次峰均滞后于4月初1 h,净光合速率后期大于前期,导致光合"午休"的原因不同,4月初为气孔限制因素,而5月下旬为非气孔限制因素。不同时期各生理生态因子间的相关系数不同。虉草净光合速率季节动态呈单峰曲线,4月中下旬最高。虉草的光补偿点为45.6μmol·m^-2·s^-1,光饱和点为1825μmol·m^-2·s^-1,表观光量子效率为0.047 mol·mol^-1,暗呼吸速率为2.1429μmol·m^-2·s^-1;CO₂补偿点为76μmol·mol^-1,饱和点为923μmol·mol^-1,羧化效率为0.0556。数据显示,虉草是一种高光效C₃阳性植物,对草地生态系统的稳定意义重大。     

欧李(Cerasus humilis)内生固氮细菌筛选、鉴定及特性研究

为探究荒漠草原灌木欧李(Cerasus humilis)根系内生细菌固氮能力和其它特性。采用无氮培养基,从欧李根内分离获得20株内生固氮菌,并结合乙炔还原法测定固氮酶活性,钼锑抗比色法测定溶磷特性,Salkowski法测定分泌植物生长素(Indole acetic acid,IAA)能力,对筛选出固氮酶活性较高的菌株进行16S rDNA序列比对,确定其分类地位。结果表明,分离的内生固氮细菌均具溶磷和分泌IAA能力。所分离菌株固氮酶活性在31.45~424.81 nmol C₂H₄·h^-1·mL^-1之间(NS 25最高),解有机磷量在26.62~99.18 μg·mL^-1之间(YNS 4最高),溶无机磷量在1.10~20.31 μg·mL^-1之间(WNS 21最高),分泌IAA量在3.86~47.00 μg·mL^-1之间(NS 22最高)。10株固氮酶活性较高菌株经初步鉴定NS1 14-1和NS1 14-2为Bacillus pumilus,NS 25和NS 26为Bacillus paralicheniformis,YNS 1为Brevibacterium frigoritolerans,菌株WNS 21和NNS 15为Bacillus velezensis,NS 8为Paenibacillus catalpae,YNS 6为Cytobacillus firmus,NNS 19为Bacillus sp.。研究分离的内生固氮细菌具有溶磷和分泌IAA的能力,有望通过后续研制微生物菌剂为干旱地区植被恢复与生态重建发挥积极作用。     

兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。     

CQ10-LPSp对紫花苜蓿幼苗内生细菌多样性及其根瘤菌的影响

为了探究成团泛菌CQ10脂多糖（Pantoea agglomerans CQ10 Lipopolysaccharide,CQ10-LPSp）对紫花苜蓿（Medicago sativa L.）幼苗内生细菌多样性及其根瘤菌（Rhizobium）的影响,本试验首先研磨分离‘巨能551’紫花苜蓿幼苗内生细菌,后设置6个不同浓度梯度（0,0.133 5,0.200 3,0.267 0,0.333 8,0.400 5 EU·mL^-1）的CQ10-LPSp与紫花苜蓿互作,再分离并测定了其根系内生细菌的种类和数量以及根瘤菌的数量。结果显示,随着CQ10-LPSp浓度的增大,紫花苜蓿内生根瘤菌的数量呈先升高后降低的变化趋势,在0.267 0 EU·mL^-1 CQ10-LPSp下根瘤菌数量最多,为6.98×10⁷ cfu·g^-1,且该浓度下根系内生细菌种类较种带细菌多样性减少。结果表明,CQ10-LPSp处理下会影响植物内生细菌的种类和数量,且在一定浓度范围内能增加紫花苜蓿内生根瘤菌的数量。本研究结果为开发促进紫花苜蓿内生根瘤菌生长的外源添加剂奠定一定的理论和实践基础。