芒果LAR基因的克隆及其表达分析

无色花青素还原酶(leucoanthocyantin reductase,简称LAR)基因是植物原花色素的一个关键基因。本研究根据已经报道的LAR基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE和5'RACE方法,从芒果(Mangifera indica)果实中克隆得到1个LAR基因,其全长c DNA序列为1 221 bp。该基因开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸,等电点为5.78,分子质量为38.38 ku。利用生物信息学在线分析软件对该蛋白组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与棉花、葡萄、蓝莓、柿等具有较近的亲缘关系;对不同芒果品种的LAR基因的表达进行分析发现,绿色的桂七品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

芒果(Mangifera indica)F3’H基因的克隆及其表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,而类黄酮3’羟化酶(F3’H)基因是花色素苷合成的一个关键酶,其参与决定了花色、果实颜色、种皮颜色、茎叶表面等花色素苷的生物合成。本研究根据已经报道的F3’H基因的序列设计兼并引物,采用3’RACE和5’RACE方法,克隆得到了芒果果实F3’H基因的全长c DNA序列为1782 bp。该基因开放阅读框为1548 bp,编码515个氨基酸,分子重量为57.44 k D。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与西洋梨、草莓、大豆等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的F3’H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

芒果UFGT基因的克隆及表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,类黄酮糖基转移酶(UFGT)是花色素苷合成的最后一个酶,它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实UFGT基因的全长c DNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp,编码463个氨基酸,分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现,该基因含有2个内含子,分别在501~1 095 bp、1 548~2 330 bp。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现,红色的芒果品种中表达量较高,黄色的芒果品种中表达量较低。     

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。     

芒果ANR基因的克隆及其表达分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,简称ANR)基因是植物产生原花青素的关键基因,对于研究原花青素的代谢有重要的作用。根据已经报道的ANR基因的序列设计兼并引物,采用3'c DNA末端快速扩增(3'RACE)、5'c DNA末端快速扩增(5'RACE)方法,从芒果果实内克隆到1个ANR基因,其全长c DNA序列为1 201 bp。该基因开放阅读框为1 008 bp,编码335个氨基酸,等电点为5.41,分子量为36.33 ku。对基因组扩增得到了1 810 bp长度的片段,分析发现,该基因含有5个内含子,内含子位置分别为130~646 bp、733~814 bp、1 017~1 080 bp、1 259~1 349 bp、1 563~1 651 bp。通过系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白与可可、葡萄等果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种中ANR基因的表达进行分析发现,该基因在绿色的桂七品种中表达量较高,而在红色的贵妃品种中表达量较低。     

芒果MinSPP基因的克隆及表达载体构建

磷酸蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate phosphatase)是合成蔗糖的关键酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机制,从芒果果肉中克隆得到1个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPP,其cDNA全长序列为1 561 bp,开放阅读框为1 275 bp,编码424个氨基酸,蛋白质分子量为48.46 ku,等电点为5.34,对MinSPP基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与克莱门柚具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示从青熟期到成熟期芒果果肉中该基因表达量逐渐上升,从成熟期到完熟期芒果果肉表达量逐渐降低,其中成熟期芒果果肉中表达量较高。本研究深入了解了芒果蔗糖合成的分子机制,进一步构建了pBI121-MinSPP过表达载体,为MinSPP的功能鉴定奠定了理论基础。     

芒果C4H基因的克隆及其表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一,其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52,分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图;通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量最高,而绿色的桂七品种中表达量最低。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

民猪NUMB基因克隆与组织表达分析

研究采用RT-PCR技术结合克隆测序方法,克隆出全长2 004 bp NUMB基因序列,其中包括1 782 bp开放读码框,该基因编码592个氨基酸。利用生物信息学分析软件对该基因氨基酸序列预测与分析发现:NUMB蛋白二级结构中,转角占很大比例,且蛋白亲水性较强,结构功能域分析发现该蛋白多肽链存在一个N端磷酸酪氨酸结构域(PTB),位于第37~162氨基酸之间。基于不同物种NUMB蛋白序列所构建分子进化树表明,猪与牛、骆驼亲缘关系最近,而与斑马鱼最远。在m RNA水平上,NUMB基因肺中表达量最高,大肠中表达量最低。     

花生酰基-CoA羧化酶基因ACC1的克隆与表达分析

ACC1基因编码酰基-CoA羧化酶,调节脂肪酸的从头合成。本研究克隆了花生ACC1基因,其DNA序列全长3 719 bp,编码区序列873 bp,蛋白质内含保守的酰基-CoA羧化结构域(124～288 aa)。利用Peanutbase数据库鉴定到15个ACC1同源基因;亚细胞定位发现ACC1主要定位于叶绿体。组织表达量分析表明该基因在种子与叶中的表达量最高,花与根瘤中的表达量较低。对不同发育期高、低油酸品种种子ACC1的表达量检测结果表明,高油酸能够上调ACC1的表达量。本研究为深入分析ACC1在脂肪酸合成通路中的分子功能提供了重要信息。     

百香果苯丙氨酸解氨酶基因PePAL克隆及表达分析

为探讨百香果中苯丙氨酸解氨酶（PAL）编码基因的序列结构和蛋白质功能，以台农1号百香果（Passiflora edulis Sims）为材料，以cDNA为模板对PePAL基因进行同源克隆，同时对PePAL编码蛋白质的结构及功能进行预测。结果表明，PePAL基因cDNA全长2 499 bp，含有1个完整开放阅读框（2 124 bp），编码707个氨基酸，蛋白质分子质量为173.43 ku。利用ProtParam、SignalP 4.1软件及TMHMM等软件对PePAL蛋白的结构预测显示，该蛋白质是一个亲水性的非分泌型蛋白，无跨膜结构域，无信号肽。PePAL主要定位于细胞核、叶绿体、细胞质、细胞膜、线粒体、液泡等部位，其二级结构由α螺旋、延伸链、β转角及无规则卷曲组成。PePAL在不同品种百香果的同一结果枝上的表达模式均呈现花中表达量最高，其次是茎，在成熟叶中表达量最低。     

薄荷GPPS基因的克隆与表达分析

牻牛儿基焦磷酸合酶(GPPS Geranyl diphosphate synthase)为短链异戊烯基合酶家族成员,催化1分子的IPP与DMAPP形成GPP,为单萜提供碳骨架。实验从我国薄荷品种"738"中克隆了GPPS大小亚基cDNA全长序列,对其进行序列分析,并研究GPPS基因在薄荷根、茎、叶、花中的相对表达量。结果:GPPS大亚基cDNA序列ORF全长1131 bp,编码377个氨基酸,GPPS小亚基cDNA序列ORF全长942 bp,编码313个氨基酸。研究获得的GPPS基因所编码氨基酸与薄荷属其他种的GPPS氨基酸序列高度相似。GPPS大亚基基因在薄荷品种"738"不同组织中均有表达,幼叶中的表达量最高。     

茶树CsH1基因结构及其内含子信息分析

利用cDNA-AFLP方法对低温胁迫下茶树基因表达差异进行了分析,获得1个低温特异表达的cDNA片段。为了获取该片段所代表基因的结构信息,在成功克隆其基因全长cDNA序列(GenBank登录号:EU716314)的基础上,设计引物,从茶树品种‘龙井43’的叶片中克隆获得了该基因全长DNA序列,命名为茶树CsH1基因(JF836005)。基因结构分析表明:CsH1基因包含2个外显子和1个内含子,外显子和内含子的剪接符合GT-AG原则,其中2个外显子的碱基序列长度分别为236 bp和608 bp,内含子为388 bp。经序列分析发现该内含子具有启动子及激素调控元件,可能对CsH1基因的特异性表达有调控作用。茶树CsH1基因的结构及其内含子信息为茶树低温特异基因的表达和抗寒途径分子调控提供了序列信息。     

葡萄SVP类MADS-box基因的克隆及表达分析

从无核白葡萄(Vitis vinifera cv.Thompson seedless)中克隆获得一个胚珠发育相关MADS-box基因。该基因cDNA全长1 248bp,ORF为729bp,编码一个含有243个氨基酸的蛋白。氨基酸多序列比对和系统发育分析显示,该基因属于SVP类MADS-box基因。采用半定量技术进行表达分析表明,该基因在葡萄的根、茎、叶、花蕾、盛花和胚珠中均有表达,但是有强弱差异。实时定量PCR技术分析表明在无核葡萄品种无核白胚珠发育过程中基因表达量先升后降,而在有核葡萄品种黑比诺胚珠发育过程中表达量一直呈下降趋势。     

越橘查耳酮合酶基因的克隆及表达分析

为研究越橘花色素苷合成的分子机制,利用RT-PCR和RACE技术从越橘(Vaccinium spp.)果实中克隆了查耳酮合酶基因(CHS)的全长cDNA,命名为VcCHS,GenBank登录号为JN654702.VcCHS全长1438 bp,包含107 bp的5 ′非编码区、71 bp的3′非编码区和1个长度为1 260 bp编码419个氨基酸的开放阅读框.该基因编码的蛋白具有CHS家族普遍存在的功能活性位点:Cys(C)164、His(H)303、Asn(N)336和特征多肽序列(RLMMYQQGCFAGGTVLR).多重比对分析发现越橘VcCHS基因编码的氨基酸序列与葡萄(Vitis vinifera)CHS基因编码的氨基酸序列相似性达90.2％.系统进化分析表明,该序列与杜鹃花目的植物聚为一类.VcCHS基因在果实发育的整个过程均有不同程度的转录表达,花期和果实成熟期表达量较高,绿果期表达量最低.VcCHS相对表达量变化与花色素苷相对含量的变化趋势具有一致性,并均在果皮组织中达到最高.     

甘草MYB转录因子GlMYB10的克隆与表达分析

根据甘草悬浮细胞经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导前后的转录组测序结果,筛选到1个响应MeJA诱导的MYB转录因子基因,通过克隆该基因片段并进行序列分析确定该基因编码1个甘草MYB转录因子,将其命名为GlMYB10。该基因开放阅读框全长为1 172 bp,编码产物包含340个氨基酸,对其编码产物的基本理化性质、亲水性和疏水性、保守结构域等方面进行了生物信息学分析和预测,对GlMYB10基因编码产物的氨基酸序列进行聚类分析。结果表明,其与木豆中MYB类转录因子的同源性最高。应用qRT-PCR分析该基因的表达水平发现,GlMYB10基因在甘草悬浮细胞受MJ诱导后的表达量明显高于未诱导组,并且诱导9 h后表达量最高。通过对GlMYB10基因进行克隆与表达分析,为探索该基因在甘草悬浮细胞黄酮类化合物生物合成中的调控作用奠定基础。     

赤眼鳟TRAF6基因的cDNA克隆及其应对GCRV的免疫表达特性

为研究赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)肿瘤坏死因子受体相关因子6基因的结构特性及其应对GCRV的免疫表达特性,采用RACE技术获得了赤眼鳟TRAF6基因的cDNA全长(共2 621 bp),其中包含5′端非编码区50 bp,开放阅读框1 629 bp,3′端非编码区942 bp;该基因编码542个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量为61670,理论等电点为6.01。SMART结构分析结果显示,TRAF6基因编码的蛋白包含1个RING结构域、2个锌指结构域、1个螺旋卷曲结构域和1个MATH结构域。系统进化树分析结果表明,赤眼鳟TRAF6与团头鲂TRAF6的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,TRAF6在赤眼鳟的12种组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,在中肠中的表达量最低;经GCRV感染后,赤眼鳟脾脏和头肾中TRAF6均呈波动上调趋势,在24 h达到峰值,表明TRAF6参与了赤眼鳟抗GCRV的免疫应答反应。     

猪繁殖候选基因ERK2的克隆、表达及基因多态分析

 【目的】ERK2基因在细胞增殖和分化调控以及启动卵巢排卵的分子信号等过程中发挥重要作用,是影响猪繁殖性状的重要候选基因。本试验对猪ERK2基因序列、基因结构、基因多态性及其表达规律进行初步研究。【方法】以大白猪为材料,采用RT-PCR方法克隆了猪ERK2基因,Real-Time PCR测定该基因在猪各组织器官中的分布,并对该基因的结构和多态性进行分析。【结果】从猪卵巢组织中克隆获得ERK2基因部分cDNA序列,长1 888 bp,包括一个1 080 bp的开放阅读框,编码359个氨基酸与预测的猪ERK2基因、已报道的人和小鼠等的ERK2基因高度相似;猪ERK2基因在各组织中表达广泛,其中脾脏是表达量最高的组织,在脂肪组织、前后腿肌中基本不表达;猪ERK2基因定位于14号染色体,全长在22 kb以上,包含9个外显子和8个内含子;对第2—9外显子及内含子外显子交界处的内含子序列进行序列突变检测,共检测到11个SNPs和1个插入缺失突变,但绝大部分的变异都是在内含子区域,仅有1个SNP发生于3′UTR区域。【结论】猪ERK2基因cDNA为1 888 bp,编码359个氨基酸残基;在猪各组织中广泛分布,以脾脏的表达量最高;该基因由9个外显子和8个内含子组成,基因保守性较高,共检测到11个SNP和1个插入缺失突变均不在编码区中。     

芝麻抗裂蒴基因SiIND1的克隆与原核表达

LOC105167765基因属于KANADI(KAN)基因家族,与芝麻裂蒴性有关。从芝麻裂蒴品种豫芝11号和抗裂蒴品种郑芝InD01中分别克隆得到LOC105167765基因cDNA序列SiIND1,并进行序列生物信息学分析和原核表达分析。结果表明,豫芝11号SiIND1基因cDNA序列全长为1 320 bp,编码439个氨基酸,推测的蛋白质分子质量为50.0 ku,等电点7.53,编码SHAQKYF类MYB家族的转录因子,具有GARP保守结构域,属于KAN家族。郑芝InD01 SiIND1基因cDNA序列长度为1 246 bp,包括1个最大的开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,推测的蛋白质分子质量为32.9 ku,等电点8.37,GARP结构域发生缺失突变,翻译提前终止,可能导致基因功能丧失。将SiIND1连接到原核表达载体pET30a,并转化大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测,表达的融合蛋白与预测蛋白大小相符合,进一步证实了抗裂蒴品种和裂蒴品种SiIND1基因的蛋白质表达存在差异,抗裂蒴材料SiIND1基因在翻译过程中发生提前终止。     

葡萄VvGW2基因的克隆及表达

为了从葡萄品种美人指中克隆VvGW2基因,并对其结构特征及表达模式进行分析.在NCBI中查找与水稻粒形基因OsGW2同源性最高的葡萄序列,根据葡萄的GW2基因序列设计特异引物.采用改良CTAB法提取美人指花序中总RNA,运用RT-PCR技术进行克隆.利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp程序进行相似性分析;利用Bioxm2.6推测分析蛋白质分子量和等电点;根据NCBI中Conserved Domains程序进行蛋白质保守域结构预测;用ExPaSy提供的在线SOPMA程序进行蛋白质二级结构预测;利用实时荧光定量RT-PCR研究该基因表达模式.结果显示,从美人指中克隆得到1个GW2基因同源序列,命名为VvGW2基因.VvGW2基因开放阅读框长度为1 272 bp,共编码423个氨基酸,预测蛋白质分子量为46 960,理论等电点为4.68.该基因编码的氨基酸具有GW2蛋白质保守的环指结构域,该环指蛋白质为C5HC2类型.与GenBank中登录的其他植物GW2蛋白质序列相似性为47％ ～53％.根据VvGW2基因所编码的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示,葡萄与可可聚为一类.实时荧光定量RT-PCR分析结果显示,VvGW2基因在美人指花或果实的各时期均有表达,其中在开花期基因表达量最高.不同葡萄品种中,VvGW2基因的表达量存在差异,在指形葡萄品种美人指的表达量最高,在圆形葡萄品种中的表达量很低.表明VvGW2基因在不同时期和不同品种中的表达量差异可能与葡萄果实形状相关.