来自5种动物禽Ⅰ型副粘病毒HN基因的序列分析

本研究对从广西5种不同动物体内分离到的禽Ⅰ型副粘病毒毒株,进行了HN基因的扩增、克隆和序列分析.5个APMV-Ⅰ分离株HN基因的核苷酸序列同源性为94.7％～98.4％,推导氨基酸序列同源性为96.3％～99％,同源性较高;5个毒株的HN基因与国内广东、山东、福建等地的当前流行株同源性较高,但与经典毒株同源性较低;遗传分析表明HN基因相对保守,都源于同一个基因亚群.     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

禽副粘病毒-2型标准毒株与不同分离株HN基因的序列测定及分析

提取实验室保存禽副粘病毒-2标准毒株Yucaipa株和3株分离毒株F4、F6、F8株的RNA，经RT—PCR，获得4株毒株的HN基因，同时测得F基因与HN基因之间的序列。序列分析结果表明，HN基因的ORF全长为1743 nt，编码一个由580个氨基酸组成的蛋白。运用DNAMAN软件分析，4株毒株与GenBank上已发表毒株的HN基因的核苷酸和氨基酸之间的同源性相比，同源率分别为99．89％和99．69％。分析F基因与HN基因间序列发现两基因间序列与副粘病毒科其他病毒的基因间序列相似，含有基因起始信号和终止信号，但不含3个碱基的连接序列。通过序列分析，在分子水平上进一步证实分离于同一批进口七彩文鸟的F4、F6株是抗原性存在差异的两个毒株。毒株间的血清学关系与分子水平的核苷酸序列、氨基酸序列的比较关系一致。     

几株野生鸟类来源的Ⅰ型禽副粘病毒分子生物学特征的研究

参考GenBank中Ⅰ型禽副粘病毒（Avian paramyxovirus,APMV-1）序列,在F基因的3’端相对保守区设计1对引物,利用RT-PCR方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近两年来从广州和深圳两个地区分离的4种动物来源共10株Ⅰ型禽副粘病毒毒株的F基因进行扩增,其扩增长度约为450bp。测序结果表明：广州株与NDV的基因Ⅵ型有高度的同源性,1个深圳株与Ⅶ型有较高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）强毒株的氨基酸序列特征;其他4个深圳株均与基因Ⅰ型有很高的同源性,其氨基酸序列均符合F蛋白裂解位点区（112-117）弱毒株的氨基酸序列特征。     

半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株，经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒、以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113，4h，对1d雏鸡脑内接种致病指数为0．23，表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因，克隆到pMD 18-T质粒载体，测序后获得F基因全序列，并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp，编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构．与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88．4％～99.6％之间，氨基酸同源性在89．2％～99.1％之间。     

新城疫病毒广东分离株HN基因的克隆与序列分析

用RT-PCR方法从6个新城疫病毒(NDV)广东分离株中扩增HN基因cDNA片段。并将其克隆至pGEM-T Easy载体进行核苷酸序列测定。结果表明，6个NDV分离株HN基因片段长度均为1704bp，编码568个氨基酸；彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为96．0％～99．8％和98．6％～100％，与其他基因Ⅶ型毒株的氨基酸序列同源性为96．8％～98．4％；但与其他基因型毒株如D26、Ulster/67、B1、LaSota以及GB Texas的氨基酸同源性较低，为88．2％～91．0％。     

鸭新城疫病毒分离株抗原表位和遗传演化分析

从规模化养殖场鸭群气管和泄殖腔试子分离到新城疫病毒(NDV)27株,用2株针对NDV HN单抗进行抗原表位分析,并选择4个分离株进行F基因高变区(374bp)和HN基因全长序列分析。抗原表位分析结果显示,27个鸭分离株均能与其中一株单抗C3-B7反应,而与另外一株单抗1E5反应为阴性。F基因(374bp)序列分析结果显示,4个鸭分离株均属于NDV ClassⅠ分支,分离株之间核苷酸同源性为99.2%～100%;分离株与NDV ClassⅡ毒株遗传距离为0.9%～9.9%,与NDV ClassⅠ毒株遗传距离为38.5%～41.7%。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列表明,4个鸭NDV分离株F蛋白裂解位点氨基酸模式为:112-EROERL-117。HN基因序列分析结果显示,4个鸭NDV分离株HN基因全长1851bp,编码585个氨基酸;同源性比较发现4个鸭NDV分离株之间核苷酸同源性为99.7%～99.8%,与NDV ClassⅡ毒株核苷酸同源性为68.4%～70.5%,与NDV ClassⅠ毒株核苷酸同源性为95.8%～98.0%。本研究结果显示,鸭分离毒均属于NDV ClassⅠ弱毒,在抗原表位和基因序列上与广泛应用的NDV弱毒疫苗株(LaSota)不同,这些毒株的来源有待进一步深入研究。     

广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析

对广西猪源I型副粘病毒F基因测序分析，为今后开展猪源副粘病毒的相关研究提供参考，也为有效防控副粘病毒感染奠定基础。参考GenBank发表的相关禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotypeI，APMVx）基因组序列，设计了1对特异性引物，用RT—PCR法分别扩增出病毒各F基因片段，并将目的基因片段回收纯化。测定得F基因的序列结果表明，从猪组织中分离获得1株猪源禽I型副粘病毒，分离株F基因112～117住裂解住点的氨基酸组成为R—R—Q－R—R-F，与强毒株DQ417113、AF458012的裂解位点一致。同源性分析结果表明，分离株与标准强毒株的核苷酸同源性分别为87．5％和87．4％。猪源禽I型副粘病毒分离株为强毒株，属于基因I型是传统型毒株，广西地区禽I型副粘病毒宿主范围呈不断扩大趋势。     

鹅副粘病毒YG97分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株YG97经10日龄鸡胚增殖后纯化，提取病毒的基因组RNA，采用RT－PCR一次性扩增出与预期设计的1.9kb大小相符合的特异性条带。将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R-T载体，经转化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，进一步进行了序列测定。序列分析表明所扩增的病毒的HN基因片段的长度为198bp，共编码571个氨基酸。同源性分析表明，YG97与LaSota毒株核苷酸同源性为79％，氨基酸的同源性为87％。与台湾1995年分离株Taiwan/95核苷酸和氨基酸的同源性分别为93％、96％，说明YG97与Taiwan/95亲缘关系较近，具有较高的相似性。与国内外部分发表的其它NDV毒株的核苷酸同源性在80％－84％之间，氨基酸的同源性在87％－91％之间。同源性分析表明YG97相对于经典的NDV在HN基因上发生了较大的变异。     

致麻鸭产蛋下降的副粘病毒的分离和鉴定

从浙江省某麻鸭养殖基地产蛋锐减的病鸭生殖器官分离到1株致产蛋下降、不致鸭死亡的病毒株(YH99V)。该病毒易感蛋鸭，经SPF鸡胚传至第9代时致病性突然增强，第11代出现对鸡红细胞的血凝特性，通常在42～80h致死SPF鸡胚，EF15EID50为10^1.8。经磷钨酸负染电镜观察，YH99V粒子呈现圆形、杆状形、葫芦状形等多形态，直径70～400nm不等，病毒外表有囊膜，囊膜外层有排列整齐的纤突。病毒粒子和包涵体位于细胞浆内。病毒抵抗力由弱到强依次为：0．2%甲醛、24h-56℃、45min→紫外线、1h→乙醚≈氯仿≈37℃、16h—pH9→pH5→1％Try。对人眼结膜易感，鸭眼结膜不易感。接种传代细胞BHK-21、IBRS-2均能引起细胞病变。YH99V株与同样引起鸭产蛋下降的AIV、鸭源EDSV无抗原相关性，而能被禽副粘病毒Ⅰ型阳性血清中和。根据试验结果，初步将YH99V判定为鸭副粘病毒。     

新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

鸭源禽副黏病毒1型YH_(99) V株的毒力测定和致病特性分析

从浙江省某麻鸭养殖基地的产蛋下降病鸭生殖器官内分离到1株致产蛋锐减、不致鸭死亡的病毒,经鉴定该病毒属于禽副黏病毒1型,命名为YH99V株。该毒株经动物回归试验能成功诱导鸭发病并回收同样的病毒,通过SPF鸡胚盲传至第9代时致病性突然增强,第11代出现血凝特性,第15代血凝价趋于稳定,鸡胚半数致死量EF15ELD50为10-4.8。MDT、ICPI和IVPI毒力学指标测定以及毒力相关基因序列结构分析表明,分离株的MDT为112h,ICPI为0.225,IVPI为0.41;YH99 V株F0蛋白裂解位点(112～117位)区域氨基酸推导序列为Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu,与弱毒株相一致。证明该毒株为新城疫弱毒株。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

NDV长春株生物学特性及与国外毒株HN蛋白基因的同源性比较

以新城疫病毒（NDV）长春株接种9日龄SPF鸡胚增殖后,进行了蚀斑纯化（三代）鉴定,差数、蔗糖密度梯度离心提纯和生物学特性鉴定。结果表明,该病毒的鸡胚平均致死时间（MDT）大于168h,雏鸡脑内致死性（ICPI）为0.25,雏鸡静脉致死性（IVPI）为0,血凝解脱时间超过120h,血凝素热稳定性56℃ 5min 仍具有血凝活性。系统发育进化树分析表明,NDV长春株与La Sota株亲缘关系最近,为弱毒株。参考多株NDV HN基因序列设计了1对特异性引物,应用RT-PCR一次性扩增出NDV长春株的全长HN基因。将该HN基因插入pKS（-）后,进行了序列测定。序列分析表明,该HN基因苷酸长度为1731bp,编码577个氨基酸,序列中有5个糖基化位点,12个半胱氨酸残基,与国外发表的NDV毒株序列相符,核苷酸同源性为88.1%～98.8%,推导的氨基酸同源性为91.1%～98.8%。     

Nucleotide sequence and vaccinia expression of the nucleoprotein of a highly virulent, neurotropic strain of Newcastle disease virus

The nucleoprotein (NP) of Newcastle disease virus (NDV) was selected to study the relative importance of an internal structural protein in the avian immune response. The NP gene of the virulent, neurotropic NDV Texas GB (TGB) strain was cloned and sequenced. Nucleotide sequence data for the NP gene allowed comparison of the deduced amino acid sequences for the NP genes of NDV-TGB and the avirulent duck isolate NDV-D26. These comparisons demonstrated an 89% nucleotide sequence homology and a 97% homology between the deduced amino acid sequences. The NDV-TGB NP expressed in recombinant vaccinia virus (rVAC) was electrophoretically and immunologically identical to the wild-type NDV-TGB. Although inoculation of chickens with the recombinant vaccinia virus expressing the NDV NP gene elicited anti-NDV antibodies in higher titers than in birds inoculated with live LaSota NDV, this strong anti-NDV response did not protect against lethal challenge with NDV-TGB.     

DP1/02株鸭源Ⅰ型副黏病毒F基因真核质粒构建及免疫试验

应用RT-PCR方法从鸭源Ⅰ型副黏病毒DP1/02株中扩增F基因并克隆入pMD18-T载体,经序列测定、分析,DP1/02株F基因与鸡新城疫病毒（NDV）国家标准强毒F48E9株的核苷酸、氨基酸序列同源性均达到99%。随后将F基因克隆入真核表达载体pCI-neo,构建真核表达质粒pCI-F,将阳性质粒体外转染Vero细胞,通过间接免疫荧光对真核质粒的表达进行鉴定,利用pCI-F质粒进行动物试验。结果表明构建的真核表达质粒pCI-F能够在Vero细胞中表达,雏鸭免疫14d后在体内可检测到特异性抗体,二次免疫雏鸭后,对NDV强毒的攻毒保护率为73%。本试验为利用F基因构建的核酸疫苗提供了重要的技术支持。     

新城疫病毒昌黎株与国外毒株HN蛋白基因核苷酸及氨基酸差异性分析

参考国外发表的新城疫病毒 ( NDV)的 HN基因序列设计了 1对特异性引物 ,应用 RT-PCR对 NDV昌黎株 (野毒 )的 HN基因进行了扩增 ,扩增产物克隆后测序。扩增出的 HN基因核苷酸长度为 1 74 2 bp,编码 571个氨基酸 ,序列中有 6个糖基化位点 ,1 3个半胱氨酸残基 ,与国外发表的强毒株序列相符。核苷酸同源性在 88.5%～ 92 .9%,推导的氨基酸序列同源性在 90 .0 %～ 94 .2 %之间。     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析

通过RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒(NDV)山东分离株(ShD-5-04)的F基因序列,对其进行核苷酸序列测定和分析.结果表明,ShD-5-04株的F基因开放性阅读框为1 662 bp,编码489个氨基酸.与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112位～117位)氨基酸组成与强毒株一致,从基因水平上说明NDV ShD-5-04株为新城疫强毒株.