新城疫病毒山东分离株ShD-5-06 F和HN基因序列分析

从山东济南某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒株（ShD-5—06）,研究其生物学特性表明,该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。从该分离株扩增出其F和HN基因,并与标准株进行同源性比较,为探讨NDV是否发生变异提供理论依据。本试验通过RT—PCR法特异性地扩增出F和HN基因全基因序列,并对其与已经发表的序列进行核苷酸序列测定和分析。结果表明,ShD-5—06株的F和HN基因开放性阅读框架（ORF）为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸。与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84．1％～88．7％之间,氨基酸同源性在88．1％～93．3％之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82．19,5～87．4％之间,氨基酸同源性在88．6％～90．9%之间;F蛋白裂解位点区（112～117）氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株（ShD-5—06）为新城疫强毒株。     

番鸭源新城疫病毒F蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%.     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析

通过RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒(NDV)山东分离株(ShD-5-04)的F基因序列,对其进行核苷酸序列测定和分析.结果表明,ShD-5-04株的F基因开放性阅读框为1 662 bp,编码489个氨基酸.与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112位～117位)氨基酸组成与强毒株一致,从基因水平上说明NDV ShD-5-04株为新城疫强毒株.     

免疫鸡群新城疫病毒的分离与分子鉴定

从免疫鸡群中分离到9株新城疫病毒（NDV），其中5株为强毒株，4株为中强毒株。用RT—PCR扩增F基因cDNA片段，并将其分别克隆到pGEM—Teasy载体中。序列分析结果表明，上述分离株F基因长度为1662bp，编码553个氨基酸，其F蛋白的氨基酸序列同源性为96．0％～99．8％；但与常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6％～92.2％，F蛋白裂解位点序列为^112R-R-Q／R—K—R—FI—G^119,均属于基因Ⅶ型NDV。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

山东地区2株基因Ⅶ型新城疫病毒的全基因组测序及其序列分析

测定了基因Ⅶ型新城疫(Newcastle disease,ND)强毒分离株Chicken/China/SD04/2011和Chicken/China/SDWF07/2011的全基因序列,将其与GenBank中已发表的29株基因Ⅶ型新城疫毒株的全基因序列进行比对,同源性在91％～97％之间.2株基因Ⅶ型分离株与中国标准强毒F48E8、国外标准强毒Herts/33及疫苗株chicken/N.Ireland/Ulster/67、B1、Clone30、LaSota、Mukteswar核苷酸序列同源性在83％～87％之间;其F蛋白前体F0裂解位点附近的氨基酸序列均为112RRQKRF117,符合NDV强毒株的特征;与单抗1E5反应阴性,结合对各蛋白的抗原位点的分析初步推测2株病毒的抗原性可能发生了变化.     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

1株鸭源Ⅰ类新城疫病毒分离株F和HN基因的分子特性分析

采用RT-PCR技术对Ⅰ类新城疫病毒(NDV)09-014分离株完整的融合蛋白(F)基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行了扩增和遗传进化分析。F基因的序列测定结果表明:该分离株F基因全长为1 792 bp,可编码553个氨基酸,裂解位点的氨基酸组成为112E-R-Q-E-R-L117,具有典型的新城疫弱毒株特征。同源性分析表明本分离株的F基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为93%～95.2%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于70.6%～72.4%。HN基因的序列测定结果表明:HN基因全长2 001 bp,可编码616个氨基酸,同源性分析表明本分离株的HN基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性在92.7%～94.7%之间,而与Ⅱ类新城疫病毒同源性较低,为70.7%～71.5%。根据完整的F基因和HN基因构建的遗传进化树均表明:本分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因3型,因此Ⅰ类新城疫病毒的F基因和HN基因具有相似的进化速率。     

鸵鸟源新城疫病毒TN株F基因的克隆与序列分析

应用PCR技术对1株鸵鸟源新城疫病毒TN株融合蛋白基因(F基因)进行扩增,将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,并与国内外NDV毒株对应序列进行比较分析.结果表明,TN株F基因的长度为1 662 bp,可编码553个氨基酸,其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,为1株新城疫弱毒株;与贵州省其他禽源(包括肉鸡、蛋鸡、越南斗鸡、七彩山鸡和鸽子等)毒株间的核苷酸同源性为84.0%～89.6%,氨基酸同源性为87.5%～92.1%;与国内外NDV代表株(Lasota株、B1株、F48E9株、CH2000株和TW2000株)的核苷酸同源性为84.4%～98.6%,氨基酸同源性为88.3%～98.0%.经系统发生树分析,TN株与NDV弱毒株Lasota株和B1株在同一分支上,属于基因II型NDV.     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

几株鸡新城疫病毒的分离鉴定及其基因型分析

从几个发生禽病的地区分离到6株病毒,经过血凝试验、血凝抑制试验、中和试验、分子生物学试验等确定为鸡新城疫病毒;根据GenBank公布的新城疫F基因强弱毒株相关基因序列设计合成1对特异性引物,扩增出的F基因片段长度约为610 bp,测序后进行序列比对,并分析其核苷酸序列和氨基酸序列,结果显示,有3株具有新城疫强毒株特性,同时还具备新城疫Ⅶ基因型特征,另外根据平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)和静脉致病指数(IVPI)指标测定结果,最终判定这3株是新城疫强毒株且属于基因Ⅶ型,其余3株病毒分离株与La Sota的核酸序列同源性与氨基酸序列同源性均为99%。     

新城疫病毒TL1株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)TL1株M基因,将扩增产物提纯后克隆入pGEM-T easy载体,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。测序拼接得出M基因的序列长度为1232 bp,该基因的ORF总长为1095 bp,编码364个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株M基因比较,核苷酸同源性为85.2%~98.1%,编码的氨基酸同源性为85.8%~98.9%。NDV TL1产生M蛋白分子中有7对碱性氨基酸,5个保守的Cys残基,与鹅源新城疫SF02株、ZJ1株具有类似的特征。这些结果为揭示NDV TL1株的分子生物学背景,阐明NDV种间传播机制奠定了基础。     

一株新疆野鸟源新城疫病毒的分离鉴定、F基因克隆及遗传进化分析

为了解新疆野鸟新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染情况,分析其分子特征和基因变异特点,防止新城疫的暴发和蔓延,本试验用9日龄SPF鸡胚进行病毒的分离传代,HA、HI试验和RT-PCR方法对位于"东非-西亚迁徙线"福海县的野鸟进行了NDV检测,分离到1株野鸟源NDV,并命名为NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016。结果表明,该NDV分离株F基因ORF长1 662 bp,编码553个氨基酸,F基因碱性裂解位点序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷,符合弱毒株特征;遗传进化分析显示,NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016与乌克兰鸽源分离株Doneck/3/968、比利时鸭源分离株Simeonovgrad核苷酸同源性均为99.7%,属于NDV ClassⅡ基因Ⅱ型。而上述3株病毒均与疫苗毒La Sota具有较高同源性（99.5%~99.8%）。本研究结果为家禽NDV外流进入自然环境提供了论据。     

Isolation and Identification,F Gene Cloning and Evolutionary Analysis of Newcastle Disease Virus Isolated from Wild Birds in Xinjiang

In order to understand inflection of Newcastle disease virus (NDV) of Xinjiang wild birds, through analysis of molecular characteristics and genetic variation, to prevent the outbreak and spread of Newcastle disease, isolation of the virus was performed in 9 days old specific pathogen free (SPF) chicken embryos, detected the wild birds in Fuhai county which was located in the migration line of East Africa-West Asia by HA, HI test and RT-PCR method. And then 1 strain of NDV from wild birds was isolated, named as NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016. As the result, ORF of F gene from the NDV isolate was 1 662 bp, encoding 553 amino acids. The motif of the cleavage site was ¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷, which was consistent with the characteristics of avirulent NDV strains. The phylogenetic analysis showed that NDV/Pintail/CH(XJ)/01/2016 nucleotide sequence homologies of F gene between reference strain Doneck/3/968 and mule Simeonovgrad strain homology were high and reached 99.7%, it belonged to genotype Ⅱ of Class Ⅱ NDV. All of the three viruses had high homology to the vaccine strain La Sota,which were 99.5% to 99.8%. According to this research conclusion we provided evidence that poultry NDV outflowed into the natural environment.     

一株蛋鸡新城疫病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究云南新城疫病毒（NDV）分子流行特性和致病性,对云南省1个蛋鸡场的组织样品进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测分离毒株,证明为NDV。通过病毒最小致死量（MLD）、鸡胚半数感染量（EID₅₀）、鸡胚平均死亡时间（MDT）、脑内接种致病指数（ICPI）和静脉接种致病指数（IVPI）测定病毒毒力,结果EID₅₀为10^-4.4,MLD为10^-4,MDT为97.5 h,ICPI为0,IVPI为0,显示分离株为弱毒株。高通量测序及遗传进化分析发现,分离毒株基因组全长为15 198 bp,从3'端到5'端有6个结构基因依次为NP-P-M-F-HN-L,各基因之间有1~48个核苷酸间隔。全基因组、F和HN基因遗传进化分析证明分离毒株属于Class Ⅰ分支,F基因ORF全长为1 662 bp,编码553个氨基酸,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-ERQERL-117,符合NDV弱毒裂解位点特征,HN基因ORF全长为1 851 bp,编码616个氨基酸,在HN基因保守区域234-NRKSCS-239位氨基酸序列没有发生变异。F蛋白有6个糖基化位点比较保守,HN蛋白有6个潜在的糖基化位点,但与LaSota相比存在缺失的和多出的糖基化位点。F蛋白半胱氨酸残基分布在76、199、338、347、362、370、394、399、401、424、514、523位氨基酸,F蛋白中性抗原位点在72、75、79和170位氨基酸发生了变异,HN蛋白受体结合部位和NA活性位点氨基酸为174R、401E、416R、526Y,未发生变异。本研究首次报道了云南省蛋鸡新城疫ClassⅠ毒株的全基因序列特征,为新城疫病毒ClassⅠ毒株研究奠定了基础。     

新城疫病毒西藏分离株的生物学特性鉴定及遗传进化分析

从西藏病死藏鸡中分离到具有血凝活性的病毒、经血凝抑制试验、电镜观察、PCR扩增和测序鉴定为新城疫病病毒(NDV),通过动物致病性试验证明该病毒对鸡具有致病性;分离毒株毒力测定结果显示,MDT为120h,EID50为10-8.44、IVPI为0.5、ICPI为0.6,均符合NDV弱毒株特征。血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示:各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差,符合NDV弱毒株的特征。F基因的序列测定遗传进化分析表明,西藏分离毒株之间的核苷酸序列具有99%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性为90%;与国内标准强毒株F48E8同源性为81%。推导其氨基酸序列分析表明,各分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸112 G-K-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株特征,与毒力测定结果相符。本研究首次报道了NDV西藏分离毒株遗传进化情况和生物学特性情况,为进一步研究高海拔、缺氧环境下NDV生物学特性变化研究奠定了基础。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。