青枯菌的运动性野生型菌株的发现和鉴定

运用ＳＭＭ半固体平板法和悬滴法，检测了不同来源的青枯菌野生型菌株１０７株，发现３０株有明显运动性的青枯菌野生型菌株，这与在科学界沿用至今已有２０多年的青枯菌野生型菌株没在运动性＾「１１」的观点不相符。青枯菌的运动性分为爬行运动和游泳２种方式，具有爬行运动能力的青枯菌还表现游泳运动性。同时笔者对数个有运动性的野生型菌株进行了检测，鉴定，结果显示，被检测菌株的检测性状与前人测定的结果相符＾「１－４」。     

山东省烟草青枯病的发生和病原菌鉴定研究

１９９０年在山东沂南县调查发现烟草枯萎的病株，分离到细菌菌株。经对各菌株致病性测定，格兰氏染色反应，细菌形态，培养性状，生理生化测定和血清学反应鉴定，结果表明，这５个菌株均属于青枯假单胞杆菌Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｉｕｍＥ．Ｆ．Ｓｍｉｔｈ。     

青枯雷尔氏菌致病性的代谢组学异质性研究

采用基于LC/Q-TOF MS的代谢组学方法,对不同致病性青枯雷尔氏菌的胞外代谢物进行了分析,获得了具有显著性差异的代谢标志物,并采用PCA数据处理方法对不同致病性菌株进行分类,建立致病性的PLS-DA预测模型。结果表明,该方法可以从代谢水平上区分野生型强致病力菌株、野生型无致病力菌株以及强致病力菌株经Tn-5转座子插入导致致病力丧失的人工致弱突变菌株。对代谢标志物的差异分析结果表明,在无致病力菌株和Tn-5致弱菌株中,有12种代谢标志物与强致病力菌株具有显著性差异(P<0.05,FC≥2),并表现出相同的丰度变化趋势,预示着这些代谢标志物可能与青枯雷尔氏菌的致病性有关。     

青枯菌铜抗性基因copA 的功能

【目的】 植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum ）引起的一种世界性重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。青枯菌Po82菌株大质粒上携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copA 的同源物,论文旨在探明青枯菌Po82菌株copA 在铜抗性、致病性等方面的生物学功能。【方法】 以青枯菌Po82菌株为研究对象,利用MEGA6.0软件包,基于邻接法构建copA 的系统发育树,探究铜抗性基因copA 在青枯菌和其他植物病原细菌中的系统进化关系。通过反向遗传学的研究手段,采用基因同源重组双交换和电击转化法,构建copA 基因缺失菌株及相应互补菌株。通过最小抑制浓度（minimal inhibition concentration,MIC）测定、RT-qPCR、Biolog代谢芯片以及致病力等基础生物学测定研究手段,解析copA 与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病性和运动性等表型生物学特征之间的关系。【结果】 同源性比对分析结果显示,copA 广泛存在于青枯菌群体中,青枯菌copA 在亲缘关系上与耐金属贪铜菌最为紧密, 与稻黄单胞菌、丁香假单胞菌和大肠杆菌的亲缘关系较远。RT-qPCR结果显示copA 的表达受到铜离子的诱导,copA 的表达量随着CuSO₄浓度的增加而增加。CuSO₄浓度为1.0 mmol·L ^-1时,基因表达量最高。铜MIC测定结果显示copA 基因缺失菌株对铜离子的敏感性增加,copA 基因缺失菌株的MIC值为0.8 mmol·L ^-1,较野生型菌株的1.2 mmol·L ^-1下降了33.3%,互补菌株恢复了铜抗性能力,表明copA 在青枯菌的铜胁迫应答过程中发挥着重要作用。与野生型菌株相比,copA 基因缺失菌株在普通NA培养基及含0.6 mmol·L ^-1 CuSO₄的NA培养基中的对数生长期的生长速率降低,表明copA 与青枯菌的生长速率相关。copA 基因缺失菌株于发病前期病情指数较野生型菌株下降,接种第10天,copA 基因缺失菌株的病情指数较Po82野生型菌株下降了11.7%。copA 的缺失导致青枯菌对α -D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低,使青枯病发病病程延长。与野生型菌株Po82相比,copA 基因缺失菌株中III型分泌系统的转录激活因子编码基因hrpG 和hrpB ,III型效应子RipX编码基因ripX 的表达量显著下调。 【结论】 铜抗性基因copA 在青枯菌铜胁迫应答、致病性等方面发挥一定的作用,研究结果可为进一步解析青枯菌的铜抗性分子机制以及铜抗性菌株的防治提供理论依据。     

山东姜瘟病病原菌的研究

1998－2000年从山东省莱芜、泰安、滕州和安丘等6个地（市）县采集姜瘟病株，室内分离纯化获得107个菌株，从中选出部分菌株，对病原细菌形态、培养性状、染色反应、生理生化反应和致病性等性状进行测定，并与番茄青枯病菌Tm2和烟草青枯病菌P.s3作了比较研究。结果表明：上述菌株均属于青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacearum(Smith)Smith）。根据对其6种糖和醇的作用以及脱氮作用。明确山东姜瘟病菌有Ⅱ和Ⅲ两个生物型，比例分别为42．31和57．69％。不同地区间生物型有一定差异。     

植物青枯细菌胞外蛋白在致病中作用的研究

 用含有转座子Tn5的铜绿假单胞杆菌PAO1826(pMO75::Tn5,Kmr)诱变我国马铃薯青枯菌小种3号菌株PO41,获得胞外多糖正常产生的接合子6000多个,经SDS-PAGE电泳筛选出胞外蛋白减少1～9种的菌株21株。经测试其中20株为原养型菌株,1株为营养缺陷型菌株。这21株突变株在烟草叶片上呈现典型的过敏性反应。用茎部毛细管滴注法在马铃薯植株上进行致病力测试的结果表明,胞外蛋白发生减少的21株突变株中有20株致病力均不同程度下降,通过分析突变株胞外蛋白缺失种类与致病力强弱的关系,初步确定59.5ku、55ku和47ku的胞外蛋白在青枯菌致病过程中起着十分重要的作用。     

罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌,结合PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。致病性试验结果显示,该分离菌株具有较高的致病性,能引起罗非鱼发病、死亡,其病理变化与荧光假单胞菌引起的鱼类赤皮病完全相似。药敏试验结果显示,该分离菌株对氟哌酸、氧氟沙星、新霉素高度敏感,但对氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林等不敏感。     

山东马铃薯细菌病害研究

从山东省8个地区18个县市调查和采集766份马铃薯植株样本中,检出带病样本736份,分离到青枯假单孢菌菌株741个,环腐菌菌株269个,软腐欧氏杆菌菌株53个。青枯假单胞杆菌和环腐菌复合侵染同一植株。对34个青枯假单胞杆菌研究表明,它们分别属于生物型Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ以及另一新类型,在血清学上有差异。两个环腐菌菌株在MR试验和血清学上亦有差异,分别属于不同的菌系。8个软腐欧氏杆菌菌株经生化测定分别属于胡萝卜软腐欧氏杆菌黑胫变种和胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜变种。     

花生青枯病生防细菌的筛选与鉴定

【目的】筛选花生青枯病的生物防治菌株。【方法】利用平板对峙法筛选对花生青枯病有拮抗 作用的生物防治细菌菌株,利用盆栽试验筛选防治效果好的细菌菌株。【结果】从根际土壤中分离的 300 余 株细菌中筛选获得 7 株对花生青枯病有拮抗作用的菌株。其中菌株 Ab、A27 和 A38 的抑菌直径超过 10 mm, 且其分泌物对该菌有抑制效果。将这 3 个菌株进一步进行盆栽试验,结果表明 A38 的防治效果最好,达到 52.72%。通过生理生化及分子生物学鉴定,将 A38 菌株鉴定为绿脓假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa）。【结 论】筛选到一种花生青枯病菌拮抗效果较好的生防细菌,鉴定为绿脓假单胞杆菌。     

用电激转化法构建杀虫防病荧光假单胞菌

 以广寄主范围质粒Pucp18和Pucp19为载体，用电激转化法，将苏云金杆菌杀虫蛋白基因cryIA（c）片段导入了荧光假单胞菌P303菌株。Southern印迹分析和Western印迹分析分别证实cryIA（c）基因的导入和晶体蛋白在P303中的表达。生物活性测定结果表明，新构建的荧光假单胞工程菌株不仅保持了野生型自然菌株对小麦全蚀病有良好的抑菌活性，而且表现出对小菜蛾、玉米螟有显著的毒杀作用。     

姜萎蔫青枯病和条斑叶枯病病原细菌的研究

从上蔡县采集上姜萎蔫青枯病病姜块和条斑叶枯病病叶分别；分离出２种不同性状的病原细菌通过形态的观察，染色反应，培养观察，生理生化反应及致病性测定，结果表明，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯假单胞杆菌「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｓｍｉｔｈ）Ｓｍｉｔｈ」，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯假单胞杆菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｚｉｎｇｉｂｅｒｉｃｏｌａ Ｒｅｎ ａｎｄ Ｆａｎ）。     

高产吩嗪-1-甲酰胺的绿针假单胞菌的诱变与基因工程育种

产量低是限制生物农药吩嗪-1-甲酰胺(Phenaizne-1-carboximade,PCN)推广应用的主要因素。本文综合使用诱变育种和基因工程改造来提高绿针假单胞菌的PCN产量。诱变育种使用亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)处理绿针假单胞菌HT66野生型菌株,以平板菌落表面的绿色PCN晶体量为指标建立高通量诱变筛选方法,通过10轮稳定可靠的诱变处理,获得的诱变高产株P3中PCN产量达到1 697mg/L,是野生菌株的3.99倍。在固体平板上培养时,P3菌株的菌落更大,PCN晶体更多且出现更早。在诱变育种的基础上进一步进行基因工程改造,敲除P3株中负调控PCN合成的rpeA基因,获得的P3ΔrpeA菌株PCN产量达到2 167mg/L,充分证明了2种育种方法结合使用的高效性。     

马铃薯青枯病拮抗菌株的筛选

 从多种植株根际土壤中分离到300个细菌分离物,通过含菌平板培养筛选出X2,B3,1J',2e'等近40株 ,对青枯病菌(马铃薯和烟草)具有较强的拮抗力,室内测定对病原菌抑菌圈达0.8～3.0 cm.挑选出1j',2e',X2和B3进一步进行室内抗菌机理、菌株鉴定和温室盆栽防病试验。结果表明,菌株初步鉴定为芽胞杆菌(Bacillus spp.)和假单胞杆菌(Pseudomonas spp.)。其代谢产物蛋白质粗提物对青枯菌的生长有明显抑制作用。温室控病效果在45.06％～82.35%,可用于有效地控制马铃薯青枯病的发生危害,具有广阔的应用前景。     

比较基因组分析斯氏假单胞菌遗传多样性及固氮基因岛进化机制

对5株固氮与11株非固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)基因组开展综合比较分析,从基因组水平上研究斯氏假单胞菌种内遗传多样性及其固氮基因岛进化机制。核心与元基因组分析发现,16个斯氏假单胞菌拥有的独特基因数占元基因数的46.37%;基于平均核苷酸相似度分析,这16个菌株被划分为11种不同的基因组变异型,表明斯氏假单胞菌基因组异质化程度高。固氮基因岛及进化树分析表明,5株固氮菌属于3种不同基因组变异型,它们的固氮基因岛及其侧翼序列保守性好,而且固氮酶基因进化树与菌株谱系进化树呈现高度一致性。据此推测,斯氏假单胞菌祖先可能通过水平基因转移的方式获得固氮基因岛,从而转变为固氮菌,但是在后期进化过程中,绝大部分固氮菌株丢失了固氮基因岛。     

短小芽孢杆菌过渡态调节因子AbrB的功能特征

【目的】AbrB是枯草芽孢杆菌中重要的过渡态调节因子，在细菌从对数生长期到稳定期的转换阶段发挥作用，但其功能在短小芽孢杆菌中知之甚少，故进一步探究其调控作用。【方法】为了解AbrB在短小芽孢杆菌中所参与的生物学功能，利用具有反向选择标记的温度敏感型质粒载体在短小芽孢杆菌SCU12中对abrB基因进行无痕敲除，获得菌株SCU12(ΔabrB)。为研究敲除菌表型变化，对细菌生长曲线和胞外蛋白酶活性进行测量，观察菌落形态和生物膜形成并利用swarming平板检测其运动性。【结果】获得一株abrB敲除菌株SCU12(ΔabrB)。生长曲线结果显示，与亲本菌株相比，abrB敲除菌株的最高OD_{600 nm}值降低24%,生长受到抑制；肉眼观察菌落形态发现菌落颜色和形态发生改变；运动性实验表明敲除菌株运动性降低；18 h以内敲除菌株生物膜形成时间提前；胞外蛋白酶活性显著增加，是亲本菌株的1.59倍。【结论】abrB基因在短小芽孢杆菌中具有广泛的调节作用。     

西瓜噬酸菌pilN基因功能分析

为了分析菌毛组装蛋白家族基因对瓜类细菌性果斑病菌致病性的影响,以xjl12菌株为背景构建转座子(Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选致病性相关突变体,通过两亲交配获得突变株,并对所得的突变体、野生型及互补等多个菌株进行致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,用反转录PCR(qRT-PCR)方法验证xjl12和突变体中hrpG、hrcV、celA表达量的差异。结果表明:突变体文库中筛选得到1株致病力明显下降的突变体Δxj-7,经亚克隆鉴定为pilN基因,其功能主要与菌毛(pili)生物合成相关。两亲交配后所得突变菌株ΔpilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明菌毛生物合成相关基因pilN对致病性有重要的调控作用。     

一株烟草青枯菌拮抗细菌的筛选及鉴定

利用不同地点采集发病烟苗根围土样的方法,从重庆黔江烟草地共采集了土样31份,经分离纯化获得一株对供试致病烟草青枯菌有较强抑制作用的拮抗菌株swu31-2,通过其形态特征,生理生化试验和16S rDNA序列的测定,初步判定属于铜绿假单胞菌.     

生防细菌MS82中GGDEF结构域基因对生物被膜形成及运动性的影响

为探究荧光假单胞菌MS82中GGDEF结构域基因对c-di-GMP调控细菌生物被膜形成及运动能力的影响,通过抑菌圈法、小试管法、96微孔板法以及运动性平板分别检测GGDEF缺失突变体MT5092、MT0189、MT19和MS82野生型菌株之间的相关生命活动能力的差异。结果显示,GGDEF缺失突变型菌株MT5092、MT0189、MT19的抑菌活性、生物被膜形成能力、运动能力(游泳运动、集群运动及抽搐运动)皆低于突变前的MS82野生型菌株,且突变株与野生株的抑菌活性存在极显著差异(P<0.01);36 h的生物被膜形成能力存在极显著差异;运动行为存在不一致的显著(P<0.05)或极显著差异。最终得出结论：缺失GGDEF结构域基因会降低胞内c-di-GMP浓度水平,进而影响MS82菌株的生物膜及运动行为。     

胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种mreB基因的功能分析

为了阐明细菌杆状决定蛋白mreB基因对胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum,Pcc)生物学特性及致病性的影响,采用同源重组的方法成功构建了该基因的缺失突变株、互补菌株及过表达菌株,并进行了相关表型测定。结果表明:与野生型菌株PccS1相比,缺失突变株ΔmreB菌体形态由杆状变为球形;对黄花马蹄莲和大白菜的致病性显著下降;生长能力也受到一定限制;尽管分泌胞外纤维素酶的能力、抗氧化压力和菌体沉降速率无明显变化,但蛋白酶活性、果胶酶活性、生物膜形成能力、游动性及产生碳青霉烯抗生素的能力均有不同程度的下降。互补菌株的表型得到了部分或全部恢复。qRT-PCR结果也显示:ΔmreB中几种相关致病因子的相对表达量均下调。表明:mreB与胡萝卜软腐果胶杆菌的菌体形态、生长能力和致病能力密切相关。这是首次报道mreB与植物病原菌的致病性相关。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种一个新的致病相关基因的克隆和鉴定

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc)是十字花科植物重要的病原菌,能引起十字花科作物发生黑腐病.本课题组采用转座子Tn5gusA5对Xcc野生型菌株8004诱变,获得17280株Tn5gusA5突变体,并从中筛选到一批致病缺陷突变体,采用TAIL-PCR对致病缺陷突变体的Tn5gusA5插入位点进行定位,发现5株突变体的Tn5gusA5插在8004菌株的基因组ORF1857内(未发表资料), 该ORF功能尚未见报道.序列分析表明,ORF1857演绎的编码产物与铜绿假单胞菌(Pseudomonase aeruginosa)的wbpL基因演绎的编码产物具有33%的一致性和45%的相似性,并具有第4家族的糖基转移酶功能域,因此本文暂将ORF1857命名为wbxL基因.对 wbxL基因进行缺失,获得的缺失突变体用剪叶法接种到寄主萝卜叶片时,缺失突变体完全丧失致病性,一段PCR合成的包含wbxL基因的DNA片段能互补缺失突变体,恢复缺失突变体的致病性.这证实wbxL基因是Xcc的一个新的致病相关基因.